传代后第13天

changbo529

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' t0 S) b! N1 W8 z9 T  J! r, P. w1 _
我也想做免疫荧光，只是悬浮生长的神经干细胞一旦贴壁就会出现分化，所以也想请前辈指导一下有没有什么方法既让神经干细胞贴壁又不让其分化？求指导

jessewill

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  ~. G9 O) D9 ]# _, l/ K. Z我觉得是你的细胞状态不行了吧，也就是说你悬浮培养的神经球已经出现了一定的分化，因此贴壁之后，你就很快看到了神经干细胞的分化。
" e& ]' x; P2 G/ O如果保持着多能型的干细胞，即使贴壁也是不会分化的。
& P4 f) j3 ]* W9 ?1 h* A) Z7 E" }所以还是从培养NSC的条件上去考虑。

changbo529

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/ w  k+ v- {+ V6 u0 w  V5 y# P4 `3 A
理论上是只要保持多能型的干细胞即使贴壁也不会分化，可是事实是我原代后第六天就看见有个别已经开始长有突起了，并且培养的神经干细胞只要一贴壁甚至培养皿中液体少时就会出现有明显的分化，想问下师兄你是怎样培养的，及怎么对悬浮的神经球做免疫荧光的，谢谢

jessewill

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/ Y+ l8 X% g5 z$ `( k& e# h+ z4 I) o& u
是啊，所以我就说你的NSC悬浮培养的时候，就出了问题。我觉得一般培养基没有问题，你看看你的bFGF和EGF的量够不够，质量能不能保证。# ]+ z8 S/ H. S
然后你好好的看看你原代培养的时候，有没有加血清这种诱导的东西。
4 P6 x: Y- d/ }% i& X' n5 B所以还是你的 原代培养有问题，跟贴不贴壁没有关系。
3 m1 d0 _& I2 y9 K- v6 D0 k! _5 j. I9 |4 t0 G
免疫荧光，悬浮的球没法做啊，你要让它贴壁上去，在做啊。但是你的都分化了，贴壁了分化的更厉害，所以你还是把细胞培养做好吧

changbo529

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" s. T4 c' z& N+ H2 ]0 J1 Q
4 \; V! M8 R' {$ K' A9 |# ?  m谢谢，前辈。不过有弟还有一问题，你培养悬浮神经干细胞的时候出现过这种问题没有？

jessewill

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" ~3 x9 X/ `1 q" z% l  S6 Z% x( G9 E5 M9 [' ]6 u; r9 \* P
没有，我建议你从 原代培养的细胞提取 血清这些诱导物质 培养基这些因素一个一个排除

changbo529

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( O* E- a0 p* `+ U1 o
0 h! H7 ]" w! p9 r" Q# V3 J+ H通过这几天的连续观察，小弟总结出一个规律就是悬浮培养瓶内的培养基量一定不能少，液体量稍一少，就会有细胞出现分化。当然液体量太大，稀释程度太大也不行，哈哈。我估计和血清没有什么关系，因为我只在消化时加入 100ul，而且离心后还要弃去液体。不知道前辈培养悬浮细胞时，怎么做细胞荧光？

jessewill

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  R+ a6 ^. H3 d% j6 x" j: D贴壁之后做免疫荧光，注意玻片要包被，你去查查。反正我是不用血清的

changbo529

回复 jessewill 的帖子' C( y: X7 l1 i* z

- I& t9 k" v- O' b# C是将神经球消化吹散后，然后再在已包被的玻片上贴壁吗？在贴壁的过程中，师兄你是用的哪些混合培养液，大约培养多长时间即可贴壁，而又尽可能控制分化在最小范围之内。我在文献上看到贴壁培养两个小时后神经干细胞基本上已贴壁，我也做过这样的预实验，用的是DMEM/F12+10%血清，两小时后取出观看确实贴壁

jessewill

回复 changbo529 的帖子1 u: @9 V. E* T: S' E! ^8 X

' `  i9 x: z1 D. M8 V# |: n10%血清你都用上了。。。还能将分化控制在最小范围内。。。。好好看看paper.protocol吧。
- k: j6 L, F% h3 E8 @诱导GFAP+的细胞，人家都只用1%血清
1 r6 M7 W* M2 m诱导TUJ1+的细胞，只需要撤掉生长因子就OK了。
  R- L2 u8 I9 r% ^5 J, {. {  ^/ L1 I$ d- q2 D
另外，神经球不需要吹散，吹散了还要神经球干吗？直接贴壁培养就好了。& e& b' E, u* `9 \; Y4 z* v
% H: g- q3 Q4 o8 Z; l8 S" G
你好好看看paper protocol吧，很多最基本的问题你没有搞懂，我怎么解释也是白搭