关于慢病毒转染的几个问题咨询

wangwang1987

1. 刚刚在addgene买了几个plasimd. 但是又四个是以Tet-o 开头，有四个是以Ptight 开头.想知道有什么区别么.
+ w! a4 r- H+ Z: j2 z) h2. 各位有用psPAX2和VSVg 包装的protocol么？因为刚刚开始没什么头绪的感觉，不知道具体用量.% c) _- B' g% S1 {+ g

telomerase

我们用的是pMD2G的那个，过程差不多6 a" y# M6 T2 N; o, B- d7 u
和包装逆转录的过程一样，我们用的是lipo，方法请参照lipo用法  h3 a! e4 ?7 |) @. ]6 X

+ T% I# z2 G6 c7 ?要注意的是：
2 f; e0 n/ ^/ K. z  Y$ N质粒的比例比较重要" i/ w+ j; h* v6 W1 H  l
细胞的状态比较重要6 n7 q6 d5 g4 N* _0 e# D
包完浓缩下，超离或浓缩柱
2 `$ x7 ^' d9 M; R3 ^) o" p- l感染时必需要加polybrene，离心效果更佳

wangwang1987

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$ \$ I1 x2 R5 S- Q" p) U  a9 p: a9 Z7 l
* J$ j* Q# e: U谢谢~还有一个问题就是2X HBS的PH的问题。因为不知道多少合适，我想验证那一个PH下可以滴度 更高。结果博后说太麻烦，让我直接做。现在只做了一个2X HBS加入细胞后第二天的液体的PH变化。我觉得这样很不准确的感觉~~但是也不知道怎么去反驳~~

telomerase

2X HBS
8 u. f# h$ j, j( F$ I# u6 f  z. F9 B! j/ {* J; b
280 mM NaCl-----8.18g / 500 mL
! w+ q& n% v: R0 w
/ P! ]+ A" p2 T( {1 V10 mM KCl-----.18g/ 500 mL
. v$ a% ]  K6 [. x, z
' |: {2 i( o# V! d  M1.5 mM Na2HPO4 * 2H2O-----.2g of Na2HPO4 / 500 mL
0 r! j# }* X1 e6 z) w1 i: \& w$ w0 q
12 mM Dextrose-----1.08g / 500 mL  - ?& R9 x2 [& ?1 c$ s7 o) X1 ^! Z* D
4 w/ }. _# I( [/ B
50 mM HEPES----5.96g/ 500 mL
+ o% S$ ?  W7 x0 {9 [% A; F  U- M- D0 {! L* m, h4 B: {
Carefully pH to 7.05 and raise to 500 mL volume. Aliquot and freeze. ' ~. P6 c) ?; N: }# E7 h4 O
是这个吗？没用过。。。。。。。。" F$ R, ~# L' g* i8 d* ^, @
但看配方PH是一定啊！！！
: D# u4 n7 Z1 `3 l2 N& E2 u

daviddow

直接用lipo算了

daviddow

直接用lipo算了

huangcong1988

回复 telomerase 的帖子8 I. E, F3 ^7 X% W; u$ P6 B
6 h8 r& A5 u8 V% j# D- k8 i
我直接是收集的慢病毒里面加PEG8000（终浓度为10%），然后混匀后静置过夜，然后6000~8000离心半个小时，然后就得到沉淀，这样行吗？我看他们有的加蔗糖，不知道我加PEG8000有影响么？

huangcong1988

回复 wangwang1987 的帖子0 S' o' v7 ~, w( [2 L

0 M9 c4 k& v6 D* q1 a; j# V- e现在包毒基本就是 FuGENE HD和lip2000，个人用的是lip2000，觉得效果还行，转染过程跟普通质粒转染差不多，要注意的也就是telomerase说的那些

wangwang1987

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8 G4 J! {; o& k& u- C1 j$ E) S* C
4 j& @$ [$ _1 G( k, i谢谢~~

xxh83121

大家的慢病毒载体都是从哪里买的？是已经包装好基因的还是空载？新手，望大家支持