luciferase空载表达

风雪叶杰

本人最近一直做双荧光报告实验的时候发 现了一个很奇怪的问题，就是之前使用PGL4空载体（没有启动子）做对照的时候测出的数值只有几百，Renilla也很低，但最近测出的空载数值总是在几千，高的时候甚至达到了5000，虽然和Renilla的比值没有太大变化，但是这样高的空载luciferase值正常吗？ 还有一半情况下luciferase空载要和插入了启动子的PGL4载体的荧光比值要在多少以上才能说明插入的启动子片段是有活性的啊？谢谢大家了4 m" y! ^5 ?: f& D1 y: m6 @+ D' G- h

不倒翁

这个值跟你转的质粒的量有很大关系

不倒翁

一般要调到6位数以上才能说明为题 那样的话只要空载跟实验组差100倍以上就没有问题

风雪叶杰

可是那是要和细胞有关系的啊，以前我用H1299来转的话转录效率和表达都挺高的，能达到百万到千万级别，可是现在换了细胞，差别只有几十倍到几百倍，通过与Renilla的比值来分析差值也只有几十倍啊，这数据能用吗？

realinter

以前转MSC，表达量好低，后来发现是用脂质体转msc效率低的原因。

yyshpy

空载确实有值，比较低，后来升高肯定是因为转染效率提高了，所以做双荧光素酶一定要看内参是不是稳定，再一个就是那个比值，才有意义，单看单个荧光量，意义不大，受到的外源因素太多了

风雪叶杰

回复 yyshpy 的帖子- Q! q6 K) V$ Y
0 Z& |! g" W# g+ Y6 u
哦，谢谢。我也一直觉得是转染效率的问题，毕竟比值一直变化不大。请问一下，如果插入片段的数值在与内参相比之后，只比空载多了3-4倍，能够说明插入片段具有启动活性吗？（启动子本身是一个弱启动子）

yyshpy

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  |- k; H& ^, o" ~可以的，3-4倍确实不高，最好多做几组重复，如果稳定的话，可以说明问题，这启动子确实挺弱的

风雪叶杰

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: A7 x. B/ [5 J2 c! c
5 v1 u7 s5 f7 U% B1 U# Q稳定性还可以，每次都可以重复出来。谢谢，还想请教你一个问题，做启动子转录因子的预测的软件有哪个是比较好的啊，我试了几个软件，给出的结果都不一样，好郁闷

yyshpy

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+ t7 M2 q, ?+ E. M
) z' t5 O2 y0 S( _5 _/ z! ~转录调控区数据库可以参考一下http://wwwmgs.bionet.nsc.ru/mgs/gnw/trrd/，另外就是预测毕竟是预测，还要结合文献，看相关转录因子结合序列特征，有助于自己分析+ a; \* }( _/ C+ H# }1 K4 s7 g