【资源】第五届全国肝病免疫和生物治疗研讨会内容集锦

细胞海洋

转载自医脉通5 u; }. V7 h3 ~5 B' D
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严重肝脏疾病的细胞治疗技术' c2 S+ B& R$ W

' i( W! ]% _, K3 E+ c  v——王福生（解放军第三○二医院）
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; ?. b$ N* g' {/ i$ M: l" i肝脏是人体的重要器官之一，具有代谢、合成、解毒、排泄和免疫等生理功能。在临床上常见的肝脏损伤因素包括病毒感染、药物性损害、过量饮酒和自身免疫紊乱等。当患者表现为严重的肝病（重度急性或慢性肝炎、肝硬化、肝衰竭或肝癌等）时，在常规的保肝对症治疗基础上，应用新型细胞治疗技术可以减轻肝脏的损害，改善病人的症状，甚至可以提高临床的疗效，促进病人早日康复。目前，国内外报道肝病细胞治疗方法有：免疫细胞治疗（NK细胞、DC细胞、CIK细胞和激活的T细胞等）、干细胞治疗（自体骨髓干细胞、自体间充质干细胞、人脐带间充质干细胞治疗）等。然而，开展肝病细胞治疗需要具备一些基本而且必要条件。例如：有符合条件的细胞制备平台和质量控制SOP、具备基础和临床兼备的专业人员队伍、符合伦理知情同意要求、获得有关部门的审批等一系列的条件。这里我们结合临床常见的肝病诊治实践，分别介绍免疫细胞治疗和干细胞治疗肝病相关的国内外进展；同时着重强调科学设计临床细胞治疗方案和客观评价安全性、临床疗效的重要性；分析肝病领域细胞治疗存在的、亟待解决的主要问题，并和大家一起展望今后肝病领域细胞治疗的发展前景。# ]5 h4 g) B; ~
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自体骨髓间充质千细胞移植治疗乙肝肝衰竭
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——彭亮（中山大学附属第三医院）
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本课题组自2005年开始进行自体MSCs移植治疗乙肝肝衰竭的研究，我们发现：移植手术成功率100%，未出现严重不良反应及并发症。自觉症状如食欲等有改善，术后一到四周，治疗组肝功能恢复较对照组好，ALB、TBIL从术后第二周开始，手术组的改善明显超过对照组；从PT和MELD评分来看，从术后第三周开始，手术组的改善明显超过对照组。另外，移植组患者MELD评分的显著改善最长可持续至术后第36周。而在最短3个月，最长48个月的长期随访观察中，我们发现：治疗组与对照组的肝癌发生、死亡情况之间均无显著性差异——并未能显著改善乙肝肝衰竭患者的长期预后；但是在移植组中，肝硬化患者与非肝硬化患者的肝癌发生、死亡情况之间亦无明显差异（肝硬化是肝癌的高危因素之一，也是导致乙肝患者死亡的高危因素之一）——该结果说明：自体MSCs移植安全有效，并可能对于肝硬化患者存在更积极的良性作用。$ W4 [5 c1 H# a# p4 ?4 r

, D4 e$ y% f+ f肝癌的过继免疫细胞治疗
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——钱其军 张迁（东方肝胆外科医院）6 y: R$ b0 m# h8 H8 E2 K
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肿瘤旧过继免疫细胞治疗(ACT)自1985年Rosenberg首次应用ACT方法治疗黑色素瘤以来，肿瘤ACT虽有进展但一直成效不佳。使肿瘤ACT陷入“骗局还是希望”的彷徨中，没有成为癌症治疗的主流方式。# g; L, z" Y4 @. L5 I/ F( [  W2 @

  m7 S$ J  m0 g' v3 r, I近年来，肿瘤ACT取得长足进步，近一段时间国外顶级杂志相继发表有关特异性细胞治疗的文章，证实了癌症免疫治疗的时代来临，Rosenberg利用T细胞过继免疫治疗黑色素瘤获得令人振奋的成功；国内越来越多的单位也开展起细胞因子诱导的杀伤细胞( CIK)的肿瘤临床治疗，并获得可喜的治疗效果。4 a3 A- S5 O  q! ~* y  `

' n' }* p, N) K" ]* a* q. H在我国有1.3亿乙肝病毒携带者，慢性乙肝患者达2300万，其中，20%-30%的患者会发展为肝硬化和肝癌，肝癌发病率亦呈逐年上升的趋势。原发性肝癌原发性肝癌有以下几个特点：发病隐蔽性，病人早期一般没有什么不适，一旦出现症状就诊，往往已属中晚期；病情进展快速性，一般从发病后到死亡的生存时间仅仅只有6个月；恶性高、难治性，即使手术能将癌瘤全部切除，术后也很容易复发；很多到医院就诊时已发展到晚期，不能进行手术治疗，即使进行放化疗治疗，存活率也不容乐观。每年因原发性肝癌到东方肝胆医院就诊的肝癌病人数约12000，而能进行手术的仅6400。
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$ J. l8 K3 _8 w* I4 _, u# Y' ^如何尽可能杀灭肝癌细胞、提高全身抗肝癌的免疫功能，从而提高晚期肝癌病人的生存时间、改善生活质量是目前必须关注的问题。. D5 g% {+ _, [/ T* @7 m8 j

1 _9 R! S) W0 W2 d. Q东方肝胆医院生物治疗科于2012年1月9日成立（2011年12月21日获总后卫生部进行临床应用的批文），主要开展针对以肝脏肿瘤为主的恶性肿瘤的DC-CIK临床治疗。在此之前我们做了大量的相关临床试验，自2011年3月开始有63例受试者，共231次CIK治疗，其中原发性肝癌41例，取得了明确效果，CR率和疾病无进展率明显提高，很多受试者在治疗期间肿瘤停止生长并缩小，生活质量(EORTC QLQ-C30)，显著改善25.89%。
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细胞回输过程的主要不良反应是少部分(30%)有一过性发热，体温在38℃以内，极少数在40℃左右，持续2—4小时后逐渐下降，一般不需使用药物处理。
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* {: H: }# U+ A, _自春节后至今我们科共有40例肝癌的病人进行CIK治疗，这部分病人大都是有远处转移、多次进行介入治疗复发及术后复发的病人，我们在进行CIK治疗的同时根据病人的情况进行相应的介入和放疗，有5例病人退出治疗。下一步我们准备在手术肝癌切除后即给予CIK治疗，观察术后复发及生存时间；结合一些药物（化疗药物及靶向治疗药物）来观察生存时间及生活质量，以明确CIK治疗在肝癌治疗中的地位。1 N" p* V, n& q/ a4 f

# N) ~! ~2 q1 N* i干扰素治疗丙肝疗效预测及病毒耐药机理
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——陈利民 （中国医学科学院）( L, X+ N" P& ?3 `$ a8 Q4 a- n1 M

  b' O% \2 t3 y: s& G: f: {2 E; _+ P丙肝病毒(HCV)感染后，80%以上导致慢性持续感染。干扰素联合利巴韦林治疗，对50%的病人有效。但存在普遍的毒副作用及费用昂贵。虽然FDA已经批准作用于HCV复制所必需的的蛋白酶抑制剂( DAA)用于难治性I型丙肝病人“三联”治疗，但广泛的快速的病毒耐药及昂贵的治疗费用限制了其广泛应用。因此研究治疗前的疗效预测方法及丙肝病毒耐药的分子机理，对开展丙肝个体化治疗及新型抗病毒药物研究非常必要。
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采用高通量基因芯片检测，我们从慢性丙肝病毒感染者治疗前肝组织内筛选出18个表达差异基因(Chen，et al．Gastroen-terology 2005)，预测病人对干扰素治疗是否有效的准确率在95%以上(Chen，et al．Gastroenter-ology 2010)。这18个表达差异基因中，大部分是干扰素刺激（敏感）基因(ISG)，而且3个基因(ISG15，  USP18，CEB)同时位于一个仅有5个基因组成的信号传导通路中（类泛素化ISG15/USP18通路）。这些ISG都在治疗无效病人肝组织内高表达。为此，我们提出内源性干扰素信号传导通路及ISG15/USP18类泛素化通路的激活与丙肝病毒耐药及持续感染有关。采用丙肝病毒体外培养系统，我们对ISG15/USP18信号传导通路在HCV复制及干扰素抗病毒活性中的作用进行了研究。发现ISG15及USP18不仅刺激HCV复制而且抑制干扰素抗病毒活性(Ran-dall&Chen，et a1．Gastroenterology 2006; Chen，et a1．Joumal of General Virology 2010)。( q: U* L2 D7 D: E( |

, D. b- d' n) z% L6 |2 Q8 g这可以一定程度解释为什么HCV感染后，肝组织内ISG高表达预示病人对干扰素治疗无效。免疫组化研究表明，这些ISG不仅表达水平有差异，而且表达具有细胞特异性，即在不同细胞内表达与干扰素治疗效果密切相关。如果ISG主要在肝细胞内表达，病人对干扰素治疗无效，如果主要在巨噬细胞内表达，则90%以上的病人对干扰素治疗敏感(Chen，et al．Gastroenterology 2010)。
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3 a* n3 Q3 G, E5 |3 ^) |最近通过全基因组关联分析，发现IL28B SNP与HCV感染后病毒的自然清除及干扰素治疗效果有关。但我们的研究表明，基于ISG在肝组织内不同细胞表达预测干扰素治疗丙肝疗效较IL28B-SNP预测疗效更加准确(McGilvray, et al．Gastroenterology 2012 in press)。. {& Z# u9 S' U' Z: U0 C
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丙型肝炎预防和治疗性疫苗
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4 l+ |* q; F8 t% z: K: c1 H) C——魏来（北京大学人民医院）
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丙型肝炎病毒感染是终末期肝病的主要原因之一。献血员的筛查显著降低了血液传播，但是，已经感染的人群是主要的传染源，不安全注射，费清洁牙科操作、纹身、透析等成为新的主要的传染源。& `$ o6 Y0 d4 s* L! _1 @$ R8 S/ N
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这些都需要预防性疫苗。聚乙二醇干扰素联合利巴韦林治疗可使高加索和亚裔人分别获得50%和75%的程序病毒学应答，直接抗病毒药物(DAA)进一步提高程序病毒学应答，但DAA也带来了更多的不良事件和耐药。即便如此，仍然有无应答和复发者。因此，治疗性疫苗仍然有潜在的临床应用价值。1 _; C! T2 {' G5 d% u- [) P

2 I+ [6 h7 M  g: ^- y8 e. `- z2 n预防性疫苗研究的主要障碍是HCV病毒易突变，逃逸已经出现的中和抗体。缺乏良好的细胞和动物模型也是障碍之一。治疗性疫苗的策略主要有四点，载体疫苗、DNA疫苗多肽疫苗和重组疫苗。载体疫苗可诱导特异性的CD4+和CD8+的T细胞应答。体内外研究都显示，MVA载体可表达HCV NS 3，NS4和NS5B，转基因鼠研究显示可诱导特异性的CD4+和CD8+的T细胞应答。I期临床试验在15例患者中进行试验，6例出现HCv载量下降。DNA疫苗主要包含NS3和NS4A，可在体外有效诱导XtNS3和NS4的应答，12例患者的临床试验安全。接受最高剂量(150微克)的3例患者中，2例患者出现病毒载量下降。肽疫苗主要采用核心区，NS3和NS4，但是，在诱导出现CD4+和CD8+的T细胞应答的同时至出现微弱的病毒载量的下降。酵母表达的重组疫苗包含了NS3和核心区融合蛋白，在体外诱导出现很强的Thl应答，在体内也可出现应答。
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细胞治疗肝硬化和肝癌的基础和临床应用研究
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——钱程（第三军医大学）0 d7 i$ y, D( w* P8 }" W7 b

+ o% W% Q# Y/ I6 h5 B慢性肝病肝硬化和肝癌严重的危害人类健康，提高它们的诊疗效果是我国社会和经济的重大需求。细胞生物治疗作为新型治疗手段所取得的疗效已受到人们的重视。- S; Z: q) i3 ~) @& H. ~

4 A" Q3 e7 D! X. l( E! E' Y8 C内皮祖细胞(endothe-lial progenitor cells，EPCs)是一种具有双向分化潜能并可参与新血管生成和组织的中胚层前体细胞。EPCs能够参与血管损伤修复和具有组织损伤修复功能。% o3 p+ _2 n9 Y2 m4 z

- A+ R! x  I" n! V6 d% a我们的研究表明，在肝硬化发生过程中，组织损伤释放的趋化因子能有效募集EPCs进入肝脏。EPCs对多种因素引起的肝损伤和肝硬化具有保护和修复功能。EPCs治疗能显著降低肝硬化的发生。EPCs的作用机制是促进肝细胞再生和组织修复、抑制星状细胞活性和减少ECM的沉积和血管新生，从来而导致正常肝组织结构的重建。临床前试验结果表明EPCs治疗肝脏疾病是安全的。提示EPCs是治疗肝硬化等肝脏损伤性疾病的理想治疗细胞。对于肝癌的细胞生物治疗，由于肝癌患者体内存在免疫抑制环境，治疗细胞功能的发挥受抑制，治疗效果有限。因此在临床治疗时需降低肿瘤负荷，采取多次输注的方式进行治疗。为增强免疫细胞的治疗效果，我们课题组和国内外科学家相继提出免疫细胞．基因疗法，即采取体外基因修饰的方法，向治疗细胞中导入免疫调节因子（如IL-12等），通过免疫调节因子的作用，改变体内免疫环境，增强治疗细胞的功能和延长作用时间，提高治疗效果。) z' J) l- B, x+ P$ j7 V

- A# ]" o- @! eHBV感染中免疫细胞介导的肝脏损伤机制研究进展! \- j0 W  l' E0 b8 y

: O3 t, f6 o" c. T/ t# F——张政（解放军第三○二医院）
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" T; I1 j+ H- Z" a: E. R3 [8 h病毒和人体免疫系统相互作用通常决定了病毒感染的临床结局。然而，在乙型肝炎病毒感染的过程中，人体免疫系统如何发挥作用？病毒如何引起宿主免疫应答而导致疾病慢性化等问题目前还不清楚？回答这些问题，对于乙型肝炎的防治十分重要。
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为此，我们对急慢性乙肝队列进行了系统的研究，结果发现：在急性HBV感染过程中，PD-1分子动态调节病毒特异性CD8T细胞功能和记忆性CTL形成，密切相关于乙肝病程进展；而在慢性感染过程中，DC功能降低、PD-1分子和调节性T细胞上调共同导致特异性CD8 T细胞功能低下，后者是导致病毒特异性CD8T细胞功能损伤是HBV持续复制的主要原因。同时肝内非特异性炎性细胞  Th17细胞等大量浸润是肝脏损伤加重的重要因素。特别是慢乙肝患者体内NK细胞，受到IL-12、IL-15、IL-18等细胞因子作用，其杀伤能力显著增加，而分泌抗病毒IFN-g能力却无显著变化，因此导致肝损伤却不同有效清除病毒。
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4 n5 ]; ?$ i, S$ K3 y. E, ^上述这些研究结果对阐明乙型肝炎的发病机制、建立乙型肝炎的免疫治疗策略提供了重要的依据和方法。
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