Artificial restriction DNA cutter（ARCUT）基因治疗潜力股

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前天听了日本东京大学化学部 小宫山真 教授的一个讲座，内容是Artificial restriction DNA cutter（ARCUT），他在讲解中提到这项技术可以应用在基因重组和基因治疗领域，兴起之下我一口气读了ncbi上小宫教授发表的与ARCUT有关的大部分论文，约为20篇左右，在这里也和站友们分享一下。
' w" P9 K8 m* Z, z: Z4 L$ m% I: M6 a先说一下这项研技术的究背景和已取得的进展，有兴趣的朋友可以下载讨论，因为我对基因工程不熟悉，所以只能用一些小儿科的理解和不成熟的语言来翻译自己，还请各位战友多多包涵哈，最重要的是多多指教指出错误！$ w6 [: x, M& M! ?( d$ L+ p7 {
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在基因工程领域，我们用到最多的就是限制性内切酶，它们能通过识别4-6个特殊碱基组合，来断开质粒或者是基因组DNA成为片段，但是即便是最优秀的限制性内切酶（实际上没有什么好坏之分），它的识别能力也是有限的，因为最多之后6个碱基位点，最多出现4096中组合，这个数字也许对像pBR322这样小的双链DNA够用了，因为对于单独一个限制性内切酶，理论上存在唯一的酶切位点。但是对于更大的基因组DNA，比如说人的，在理论上就会产生几万个酶切位点，没法用来研究。更者，有的时候我们想研究的DNA片段上没有什么可以用的酶切位点。这就需要一个更加优秀的工具，来帮助科学家们特异性的断开他们想断开的碱基。而ARCUT就是干这个事儿的。
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6 Q$ |  @. Y, |' U; c3 V0 i小宫教授在02年的时候，发现Ce(IV)/EDTA这一组合对单链DNA的水解效果非常好，而对双链DNA则几乎没有水解作用，他根据这一特点，想出了两种在特意位点切断DNA单链的策略。第一种，设计两个DNA片段，分别与目的DNA的前半部分和后半部分互补，在中间留下一个几个碱基的gap（例如，目的DNA长800，第一段DNA从1-200互补，第二段从206-800互补，留下了5个碱基的gap），这时候引入Ce(IV)/EDTA复合物，就可以专一性地切割中间的单链部分，经过几年的不断改进，这个gap可以被缩小到1个碱基，专一性和效率也大大滴提高，两个DNA片段只需要与gap附近几十个碱基互补配对即可，露出的片段两端的单链DNA也不会被Ce(IV)/EDTA复合物水解，非常神奇（其中原因也在文章中进行了研究和分析）。 第二种策略，是用一段DNA片段与目的DNA互补，但会在目的DNA片段的特异性位点附近产生一个bulge，因为bulge是单链的，所以就会被Ce(IV)/EDTA复合物特异性第水解，经过多年的改进，这种切割的效率和特异性也大大提高。通过这两种不同的方法，作者达到了在没有任何酶的帮助下，在想要研究的位点特异性切断DNA的目的。0 p1 W) \9 L" j5 {- l: \
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但是特异性地切割单链用处不大，能切双链才有更多的应用价值。小宫教授通过引入PNA，实现了这一目标。PNA是一种特殊的能于DNA互补的分子（具体是什么大家看文献吧，我也说不清楚），为了增强特异性，一般设计的长度为15碱基左右（和设计引物道理一样），用PNA 的好处是，能做到非常专一（即使有一个碱基的错配，也不会造成非特异性结合，而这一点是DNA做不到的）。举个例子，如果我们想切割pBR322质粒的1821-1825,1836-1840（这个区域没有酶切位点存在），就设计两个PNA，一条互补于DNA的1821-1836区域，另一条互补于另一链DNA的1826-1840区域，将PNA与质粒混合使PNA与质粒DNA互补，这样在质粒的1821-1825,1836-1840区域就会露出长5个碱基的单链，这时候加入Ce(IV)/EDTA复合物，就会将单链特异性地切开。但是切在这5个碱基的哪个位置呢？研究发现，都有，但是比例不同。只需要一个特殊设计的DNA连接子，就可以找到并利用自己想要的那个切割产物了。1 A: U' J% I5 ~1 o

* Z9 L9 K& C3 M作者分别对质粒、腺病毒载体、大肠杆菌基因组和人的基因组实施了这项技术，发现都可以特异性地切割想要切割的DNA位点，从而说明了这项技术的适用性。
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. [: d; e0 o( s" v+ D现在小宫教授已经可以利用ARCUT技术诱导细胞的内在机制，实现初步的同源重组，因此这项技术对于基因治疗还是有非常大的潜力的！
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由于我是角膜缘干细胞版块儿版主，所以发在这个地方，在这里先向大家的光顾表示感谢，也希望大家为角膜缘干细胞版块儿的建设提出意见和建议！
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