【请教】外周血分单核细胞培养DCs的详细步骤

wagumaxida

$ u8 j# z# ]. S4 F; a$ w
5 _/ S3 e0 }0 M( r: S5 N1 y' ?0 K主要有几个问题亟待解决
5 J3 [' i% B9 m4 d+ b, C1.外周血分淋巴细胞时，梯度离心去除血小板时，离心梯度是怎么设置的？
+ W- g* H3 ?: T- J1 U2.淋巴细胞贴壁获得单核细胞时：
: o: s1 x9 n7 I% H5 p9 {$ _8 [  A.贴壁时需要加血请吗？需要加细胞因子吗，需要的话加哪些，量是多少？5 u3 b; M4 e. R) s/ O- E
  B.贴壁时间是多长时间，2h还是48h？
7 V2 r9 w3 n! A; {7 J$ N5 v" r  C.贴壁时是在培养瓶中好还是在六孔板里好？
% q. A! A" u/ W2 L1 ]5 |  D.这一步还有什么要注意的吗？3 c4 v4 e6 ]( M) G, o) A
3.单核细胞诱导培养成未成熟DCs这一步：
2 N3 g3 |4 \1 x0 W7 `" c+ y  A.换液间隔怎样？半量换液还是什么其他方式？
7 z4 A# d$ s) J. i0 S; X8 V3 A; U! Y  B.换液时所用培养液中因子的量是多少？( l  a! D4 v! d5 ]& K5 u
4.未成熟DCs诱导成为成熟DCs这一步：. E; T1 H4 H' H% Q* t+ g
  A.在第几天开始诱导？( v4 F/ z& w# a6 r+ L( F0 `
  B.用什么因子或者药物进行诱导，量是多少？+ z' N: k0 L- ^9 u2 S6 w
  C.诱导时还要继续添加GM-CSF、IL-4之类的吗？+ A9 M/ H7 K; G* B- g
  D.诱导多长时间可以收获？
% f* L2 f. Q( x$ fP.S. 如果要用荧光腺病毒感染的话，在第几天哪个阶段感染会比较好？9 i) c7 b3 d4 M! O

8 M9 R9 e4 S! x" [' a( M: s6 O非常感谢！

zhenhuale

同样的疑问，培养的过程中一直存在

luoziwei

持续关注

大少爷

1.我们用久保田的离心机，第一次1500rpm（大概400g），10min，第二次1200rpm，10min，第三次1000 rpm，10min。
+ O) `2 [0 v+ x& q* b/ r. k) l2.淋巴细胞贴壁获得单核细胞时：( |  ]1 g& U5 d& w* g3 {# _
A.贴壁时不加血清，不加细胞因子。4 C, [5 N0 V8 T5 L* m
B.贴壁时间是2.5h
; w" T. C  L% h( f C.贴壁时是在培养瓶中或培养皿。
! @- L4 {# G' P- p
9 X1 C3 l8 ~' m. G* ^2 L1 @0 |) k3.单核细胞诱导培养成未成熟DCs这一步：
" \, i# I) R: i% o6 A A.换液间隔一到两天，半量换液
# r. f+ U. y  M1 CB.换液时所用培养液中因子的量是1000 U /ml的GM-CSF和1000 U /ml的IL-4+ ^5 B- I; u) D
4.未成熟DCs诱导成为成熟DCs这一步：
- A; B( P% P7 n' V" ^, E A.在第五天开始诱导
6 s  |/ X& g) B/ c$ ]% i& Y B.用TNF-α进行诱导，量是50ng/ml。2 s# q! n; y* _+ f! J" ]! y
  C.诱导时还要继续添加GM-CSF、IL-4。
/ {6 r/ x+ H8 d  D.诱导一到两天，显微镜下观察细胞，细胞变为毛刺状悬浮细胞，终止培养，可以收获。

大少爷

1.我们用久保田的离心机，第一次1500rpm（大概400g），10min，第二次1200rpm，10min，第三次1000 rpm，10min。
3 k, `* w; o# _2 ^2.淋巴细胞贴壁获得单核细胞时：1 N0 K+ O0 [- G4 ]
A.贴壁时不加血清，不加细胞因子。
; ?! L8 M* Y  g8 A. I" K/ |' C0 t/ C2 \ B.贴壁时间是2.5h
$ W' |/ d0 U0 U% t- o& z C.贴壁时是在培养瓶中或培养皿。
- n( Y& b3 r) J& r# F  N9 Y: I
, ]' a" J# S3 e3.单核细胞诱导培养成未成熟DCs这一步：
3 M! p' J) T: m: d4 u8 l  g A.换液间隔一到两天，半量换液
6 R0 A5 o. h. ?B.换液时所用培养液中因子的量是1000 U /ml的GM-CSF和1000 U /ml的IL-4
$ e; b& @5 b: j7 R* b4.未成熟DCs诱导成为成熟DCs这一步：
* f) ]/ o6 [6 q7 g A.在第五天开始诱导; L# D, C3 Z  Y8 H3 Y7 t9 `* N6 I  P1 E
B.用TNF-α进行诱导，量是50ng/ml。' R9 N/ s- ?: L8 y; B7 J) c- k7 Z
  C.诱导时还要继续添加GM-CSF、IL-4。
- U1 \- @6 \; |7 l. K5 I6 k  D.诱导一到两天，显微镜下观察细胞，细胞变为毛刺状悬浮细胞，终止培养，可以收获。

wagumaxida

大少爷 发表于 2012-5-18 22:16
, T$ F+ F4 \' f3 @' g9 i8 J1.我们用久保田的离心机，第一次1500rpm（大概400g），10min，第二次1200rpm，10min，第三次1000 rpm，10mi ...

: q2 w% s4 e) k& |4 b  u感谢 另外收获后的维持培养也需要加细胞因子吗？ 需要加什么

hwlightning

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5 ^2 v; G. W0 |
5 Q+ ]7 K2 `, k* p请问下GM-CSF,IL-4和TNF-α国产的就行还是要进口的？能推荐下厂家吗？

vanessa

大少爷 发表于 2012-5-18 22:16
6 e. I9 g# r' W. {1.我们用久保田的离心机，第一次1500rpm（大概400g），10min，第二次1200rpm，10min，第三次1000 rpm，10mi ...

! \, J1 I) R2 w4 |4 l7 G8 [第一步我们一般是根据淋巴细胞分离液说明书来进行操作的，一般国产和进口的Ficoll离心力会有所不一样。

hwlightning

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* @8 \5 C2 [2 ^7 b
/ H  B8 }1 G- p$ |( W! n活性单位U与质量单位ng怎么换算啊？

大少爷

活性单位U与质量单位ng好像没有换算关系，每种抗生素好像都不一样。。。