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各位大侠，下面是我分离培养EPC的详细步骤，分离后的前三天可见细胞增殖，后来细胞就不长了啊，甚至出现类似神经细胞的形态，请各位帮忙分析！
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# \- H; B, v, C+ U7 s, v1.颈椎脱臼法处死小鼠，75%乙醇浸泡消毒10 min，剪双侧股骨和胫骨，去皮，入超净台尽量剔除附着的肌肉和脂肪组织，暴露骨髓腔。& y9 d6 E7 D8 u$ {/ X) {& ?
2 Q' \+ s& N$ S, s- J2.用消毒针头在两端各穿一小孔或无菌剪剪去箭端，注射器抽取PBS冲洗股骨干、干箭端及胫骨骨髓腔至清澈，40um滤网过滤；
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3.骨髓滤液转入离心管 1000rpmX5min离心，去除上层脂肪及组织液，收集管底细胞， PBS 3ml重悬细胞，按 1:1比例，用滴管沿管壁缓慢叠加于Histopaque 1083分层液面上，注意保持清楚的界面，2000rpmX30min离心。
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/ d8 U8 D" R& [ x k7 D4.离心后管内分为三层，上层为PBS，下层主要为骨髓间质细胞、红细胞等。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。用毛细管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一离心管中，加入5倍以上体积的PBS液，1500rpmX10 min，洗涤细胞两次。8 R/ Z: F* v4 B) b, a* h. ^
/ s, A! {; `- k& [, k- E" M8 b5.末次离心后，弃上清，加入EGN-2培养基重悬细胞。以2X10^6/cm2密度将细胞接种于已用200 μg/L纤维连接蛋白包被的培养瓶中，37℃、5%CO2条件下培养。
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6.细胞培养24h(早期贴壁)后收集未贴壁细胞，1000rpmx8min离心后以EGM-2培养基重悬培养。
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发表于 2012-5-24 18:45
