IRES-EGFP可不可以放在SV40 promoter-NeoR的后面？ - 实验室综合讨论区干细胞之家



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查看: 42974\|回复: 10	go [请教] IRES-EGFP可不可以放在SV40 promoter-NeoR的后面？ [复制链接]

miRNA

新手上路

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楼主

发表于 2012-5-29 14:38 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

IRES-EGFP可不可以放在SV40 promoter-NeoR的后面？
因为各种原因，IRES-EGFP不能放在CMV-插入片段的后面，
所以....
r$ t* w" R# Y/ c4 S; n
另外，有没有这样的质粒，GFP和插入片段的启动子是分开独立的？

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沙发

发表于 2012-5-30 08:13 |只看该作者

为什么IRES-EGFP不能放在后面，买的载体不就是CMV起动的目的基因后面连上IRES-EGFP吗？

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BenHantun

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藤椅

发表于 2012-5-30 08:13 |只看该作者

为什么IRES-EGFP不能放在CMV后面，买的载体不就是CMV起动的目的基因后面连上IRES-EGFP吗？

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wcfeng88

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板凳

发表于 2012-5-30 08:48 |只看该作者

可以通过酶切把CMV启动子去除后，再插入你的目标片段。如果gfp和你的目的片段需要分开独立的启动子表达，你可以先用克隆载体T-vector分别构建好“启动子1+gfp”和“启动子2+目标片段”的克隆载体，然后再把它们连接起来。

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zack

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报纸

发表于 2012-5-30 09:49 |只看该作者

IRES-EGFP可不可以放在SV40 promoter-NeoR的后面:这个确实是一般公司构建载体连接元件信息的顺序，不是很明白楼主说放不了。6 @( W, L T% U' A8 H

另外，可以用2A序列连接，独立表达目的基因和报告基因。

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miRNA

新手上路

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地板

发表于 2012-5-30 12:26 |只看该作者

回复 BenHantun 的帖子
2 @7 x* u: `- P5 G# A# i$ ^
因为插入片段还有3'UTR，而3'UTR区里面有几个polyA位点，我担心，转录还没到IRES-EGFP就转录终止了。所以，有2个方案，一个是用2个独立的启动子，就如同wcfeng88说的那样，而如果用这个方案，CMV+目标片段+另一个启动子+GFP，我想用弱一点的启动子来启动GFP的表达，而载体本身就含有弱一点的启动子SV40(用来启动NeoR的表达)，所以，我想干脆将IRES-EGFP放在SV40-NeoR的后面，这样不就很方便吗？