Ips的MEF饲养层细胞密度

yuhaoze

想请教一下大家 诱导IPs用的MEF饲养层细胞密度多少？ 我照着文献里说的，先用丝裂霉素处理，再用2*10四次方/平方厘米的密度接到板子中，发现细胞会慢慢变得很大，于是就没有什么空隙来给其他细胞贴壁了。$ E% t0 H# @# J" ^
这样的话能达到饲养层的效果吗？ 大家都用什么密度，步骤是什么？8 K3 S; ~$ ?8 H1 [0 n: i6 o
谢谢！

zmm

如果是MEF细胞增殖的话，那就是你mmc处理时间不够。。。接种的密度比较合适

cherrysung

这个密度是合适的，可能是MEF本身分离处理时有问题，也有可能是培养基的问题

mqz_11

每个实验室都不太一样，但大体都差不多，你用的密度也没啥问题，关键是看本实验细胞长的状态。一般10cmdish 铺 1.2*10 6个细胞左右（也可以铺一个六孔板）。。

yuhaoze

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  n8 I' I8 j- U7 a( V
, }& v% J( Z% u2 A; p# H- D谢谢！可能是我的MEF老化了，变得挺大的

shewawa

回复 yuhaoze 的帖子! \3 @, S6 a% a% a+ K( H) X
; w8 Y3 Y- I( a: e
细胞用量
. t: W8 N, h! ]2 z0 Dhuman iPS cell generation + b$ X5 J2 x) r5 b4 ?  s# H& ^, m7 b, _
100 mm Dish 1.5 x 106' z! @- F) a8 z: Q% V) R
60 mm Dish 5 x 105+ e( [% i; ~) `4 x: v' T
35 mm (6-well plate) 2.5 x 105
% C/ c" q. `( S. V2 n) F24-well plate 6.3 x 104
( {" t2 J. s* i# ymouse iPS cell generation　(human x 1.5)这个是ＳＮＬ的用量。ＭＥＦ用同样数量也ＯＫ。
, i8 P  j# S; S4 n, aＭＭＣ处理时间为２.２５小时，浓度12 mg ml–1.参考文献Induction of pluripotent stem cells from fibroblast　cultures。8 f. m3 l: n( o# f$ E
因为人的干细胞形成率非常低，很多ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ什么的都会正常生长，最后会看不到ｆｅｅｄｅｒ，但是我的经验是这并没有影响ｉＰＳ长出来，可能影响生长率，这个没有调查过。

yuhaoze

回复 shewawa 的帖子+ ~; J# @7 X' }! x
9 p* `: `. ^8 @7 A; t& ?. o
谢谢！记下了！就是想问一下您觉得MEF在什么状态下，处理的效果最好呢？

shewawa

回复 yuhaoze 的帖子8 k0 n5 S. ]& }* l: d. v& L  l/ ~

' b" x) |- f/ e: C& ?0 `9 A2 {我们一般做到P5，under confluent的状态下处理。你要是不嫌浪费P3MMC处理也行吧。

yuhaoze

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& k8 O% _. t0 R  ]# m- R& F6 t
' ]: ^+ n) A6 j6 Y8 e1 B/ {" ]浪费倒是浪费不了多少，主要是刚开始做，先做出来再优化系统也行。谢谢哈！

chentian820

MEF在经过mmc处理之后，失去增殖能力。这样的细胞在铺盘以后，形态一天比一天不同。刚开始就是像初始的成纤维细胞，然后慢慢地胞体塌陷，整个细胞变得扁平，最后会铺满整个皿底。如果是因为增殖而使得空间不够的话，那MEF的形态仍然应该是细长形。所以你的mef做得应该还可以。