如何提取卵母细胞

wxl87

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thank you

moluxingke

如果是大量收集卵母细胞，可参考08年的这篇science，PTEN和卵泡发育相关的一篇文献；& D* p5 u# u; ]4 L2 P. n
大致方法如下：卵母细胞分离方法：
+ z7 x, c# }1 G1 小鼠脱颈处死，取出卵巢，在显微镜下剔除脂肪垫和多余组织。
1 f7 f  j! B4 q( ~2 将卵巢剪碎，然后胶原酶消化，消化过程中不断吹打振动。
- _' J' Z" J* l7 B+ Z1 R0 V' c9 q  胶原酶溶于DMEM/F12培养基中，浓度为0.05%，培养基添加0.4%（g/ml）的BSA，100U/ml的青霉素和100ug/ml的链霉素，
, n5 d# q$ F/ w% ^0 _3 大约40-60min以后，待组织消化基本完全，往消化液中加入EDTA至终浓度为40mM，然后于37℃孵育15-20min，期间不时搅拌，直到颗粒细胞以及其他细胞类型完全散开。+ R. S; y7 n* |  H  j" E) t
4 将细胞混合液洗涤一次，然后于上述不加血清的DMEM/F12培养基中培养12h，使颗粒细胞和其他细胞贴壁生长，未贴壁的卵母细胞和血细胞被聚集到上清液中，室温1000rpm离心5min，然后血红细胞经过低渗buffer出去，（含144mM NH4Cl和17Mm Tris-HCl Ph=7.2）。
5 L( A0 M  h# k0 b; F# M5 洗涤几遍以后，离心收集卵母细胞，加入裂解液裂解后，14 000rpm 离心20min，4℃，取上清测BCA法蛋白浓度，待用。
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        具体方法参见：   Pradeep Reddy, et al.  Science，2008
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