SSC的原代培养疑问

varing

       最近在尝试从成年小鼠SVJ睾丸中获得SSC。
, A" l- {! C* u  _    用两步消化法获得原代细胞后，在0.1%的明胶，SSC GROWTH MEDIUM 中培养，现在已近培养了4天了，贴壁的杂细胞出现空泡。现在有个疑问，这样的情况的话，是培养基体系出问题了么？应该杂细胞能健康的长才对，各位在SSC原代中培养7天后，杂细胞会长很多么？

ying

正常的。据我的经验，如果不用Thy1+MACS来富集SSC的话，直接用total的消化下来的细胞，至少要2-3周才能看见像克隆的东西。
* ]& n  K1 ~. Z0 T0 ~( G你有用差异贴壁的方式先富集一下不贴壁的细胞吗？而且即使如此，仍然要2周甚至更久才能看见克隆状的细胞。就是很慢的。/ L6 P1 q) _3 Q9 w" D; v! h
杂细胞确实会出现空泡。正常正常。在前两周，杂细胞都是dominant的多，SSC很少很少很少的。慢慢来慢慢来，这玩意儿就是慢得很。
4 u) U8 f; q% H+ w- L建议上图。

varing

回复 ying 的帖子
1 t0 S% U  R- m2 `: Z, F6 g0 {& S$ G$ e% ]3 k- a
非常感谢 确实没用贴壁富积 现在培养四天了 杂细胞是贴壁了 但细胞数还是少 且有空泡 不知会不会杂细胞慢慢长多
( x! r# I8 ?# R, A还想问您一个问题 形成克隆后 克隆会贴在杂细胞上层？  A- [$ N7 b' c  k0 x* A5 B

hcluo

建议用MACS或者FACS进行纯化分离的细胞以后，再进行精细，精心的培养。可以的，就是要有耐心，细心，信心。

ying

回复 varing 的帖子# x7 q8 {' v8 I. J& E& U2 C
* u$ S/ y1 u7 M2 H6 b
据我的经验，最后看见克隆的时候 其实就只有10-50个克隆，换而言之，你现在看见的那么多乱七八糟的细胞其实和我们的事情一点关系没有，只有几十个我们要的细胞夹杂在细胞海洋中。杂细胞其实基本上不会怎么长的，因为它们是原代成体细胞。8 h0 o7 @, T- q- ~
克隆会贴在杂细胞上层。' R; A4 \8 q# I1 I: @2 \
你换液的时候要把换下来的液离心一下，将没有贴壁的细胞也留着，用新鲜培液悬起再加入到原来的碟里面。因为SSC贴壁性很不好的。

varing

回复 hcluo 的帖子# P" l& e* ?4 T7 f2 Y( \

3 h4 f5 R! X' c6 gThy1膜蛋白？但选抗C还是N端得抗体呢？有这个想法，磁珠分选后可能好养些。

varing

回复 ying 的帖子+ O7 z  V% J! Y3 ^

4 Y) ^# `4 _2 D3 g非常感谢 换液操作和我现在实行的一样 以后有其他疑问还要多向你请教  

ying

回复 varing 的帖子$ i9 r$ w, M- M% s1 n' s" P' H( `
' I) o2 w' @7 n. j0 P3 |
你可以上网找一个MACS分离SSC的protocol,肯定会有讲到用什么公司的什么抗体的。我自己只用MACS做过一回，是借别人的东西做的，所以无法提供给你抗体信息。Thy1+MACS富集SSC，这个是常规操作，不是新想法。

hcluo

回复 varing 的帖子
2 W" k; r2 z! I9 b" V4 K# t9 E" I' n  S# T+ p" a
建议你分析一下THY1的跨膜结构（看看是N端还是C端在膜外）。这样可以更好的选择抗体。