怎么通过基因表达来检测细胞凋亡？Fas和Bcl2，bax，BclX能不能检测？

jiojoo

  Q* v4 f6 v7 c# d+ u8 F

% L6 E  X. O' @! A# h* t; ]. B7 V因为样品已经没有了，只是还有cDNA样品，想顺便检测下细胞的凋亡情况，所以就定了几条引物跑了个qPCR
5 [* e" Z3 ~2 c  Z" f' u! S4 K; q结果如下图5 i+ a7 n0 m9 o: ^! s: D
B组是对照，三个处理组，分别是D组、F组和H组，3d和5d两个时间点" z& p; }+ v6 H$ Y' h: J# t

2012-7-17 23:37 上传

下载附件 (96 KB)

$ L& r/ _: A3 p! B, s; C2 |5 E8 i这张图片能不能说明一些凋亡情况的？/ V7 B! X7 V7 X- C& Y( D6 ]5 `
或者需要做哪些基因才比较好？
3 b1 C1 |3 \( s2 D. t  [0 [期待大侠的意见，非常感谢！

yuhaoze

Fas是受体吗？ CD95R？- t# b1 G9 Y4 p5 j  y1 _. w
我看其他三种都是信号通路下游的一些凋亡因子，可不可以检测caspase呢？' u" O! M/ w5 v' l
不知道你研究的是那一块儿，但要是想检测凋亡的话，通常情况下是western检测活性的caspase8/10/3/9等等) y4 d7 _9 u0 f) U4 i  _9 F/ E

希望之光

凋亡相关的基因有很多，首先你选择的这几个是不是和你的实验目的相关，单凭图中的数据来讲，并未发生凋亡，或者说个别的根本就没凋亡。再看看相对表达量也不高所以呢建议楼主再仔细琢磨一下

妖妖空

我们可以好好交流一下的，我最近在做的是过氧化氢诱导的HL-60细胞的细胞凋亡的实验，也是第一次做这方面的实验，昨天96孔的板刚刚给药，今天先大致检查一下细胞形态，做下荧光染色，看下凋亡小体等的情况，做个DNA电泳，看下DNALadder。最后检测一些较明显凋亡细胞的细胞膜外侧的磷脂酰丝氨酸（ps）的含量，请问这样做初步筛选来确定能引起凋亡的浓度范围，行不行。谢谢指导。

妖妖空

回复 yuhaoze 的帖子6 ]: W, r+ J4 s3 C- J
; A3 ?' c8 v( H
一般检测caspase的时候，起始caspase和效应caspase都要检测吗？通过特殊的caspase检测能确定凋亡是内源途径还是外源途径吗？

妖妖空

回复 yuhaoze 的帖子1 x, X( o: \7 y

6 ~, ?+ y, N9 ^  B8 ]Fas是外源途径中的受体，它的配体是Fasl。Bcl2家族对凋亡有抑制作用，其他两个蛋白家族对凋亡都是促进作用。

yuhaoze

- c' h/ g0 X5 [  U& ^6 g2 l5 F5 V+ t+ c" [0 a( {* c$ E, H
检测那三个是一个anti两个pro，如果检测受体的话你就默认了那是fas外源性通路，但是外源性通路受体至少有4个。我这里有三个想法：& C$ `  u# Z( v$ K# O( f; ?
1.这个要看哪个快，一般如果在凋亡一开始就能检测到大量活性的caspase8/10，而细胞色素C和caspase3滞后的话，那很可能就是外源性途径。通常的作法也就是检测3个 caspase 8、10、3， 再多了也没有意义。7 F4 H" h8 t. @% I; Z
2.个人认为（因为有将近1年内有看这方面文献了），外源性通路和内源性通路的差别在于，capsase3和capsase8/10, 哪个是上游，哪个是下游。如果激活外源性通路，capsase3是下游，如果内源性通路caspase8是下游，我只是说一般情况，现在研究出了capsase12通路等等，就不在这个探讨的范围之内了。
8 M. v  C! e0 X9 f, u% H3 }根据这个判断，你可以用特异性的capsase抑制剂，来抑制其中一个，看看另一个的激活状态是否改变。举个例子，如果你抑制了caspase8,发现caspase3从大量激活状态变成了没有火星的状态，那就可以证明caspase3是下游。' j) k0 B5 ]7 _4 D
3.有一个连接受体和外源性起始caspase的蛋白,FADD,在各种外源性通路中都有参与，也可以检测这个。# r6 ]1 u- Y3 L

# Z2 ]& J/ q! m, u0 N/ W' R/ X  O/ F. Q" ]# X+ M

$ j- X. d) s0 c; q6 I0 ^% P我写过一个英文的东西，可以传给，你不知道会不会对你的想法有帮助

yuhaoze

检测磷脂酰丝氨酸这一步必须要做吗？我觉得很贵，而且你前面几步已经能够说明问题了，可以直接进入通路研究了

jiojoo

回复 yuhaoze 的帖子1 V9 O+ G8 T( _7 r/ }4 D
. x2 Q6 X0 v- K6 t
感谢回复，因为我并不是做凋亡这一块的，凋亡相关的东东完全不懂。, H2 Y. E  m! r# T
我只是看到其中一个组细胞7d之后都死光了，所以就想看下是因为坏死还是凋亡，另外，因为现在的样品还有cDNA，所以就只是想做个初步的实验来大概地判断一下$ Y' z4 ^3 ?3 X2 E3 r+ u( ]
Fas在NCBI上的描述是Mus musculus Fas (TNF receptor superfamily member 6) (Fas), transcript variant 1, mRNA
# `8 u' D$ }. l: u" _7 ]NCBI Reference Sequence: NM_007987.28 O# e% k; [- u9 o3 ^. R; A' B# {

4 x' n8 f5 E' ~; @' ?( m" EBclx是Mus musculus BCL2-like 11 (apoptosis facilitator) (Bcl2l11), transcript variant 2, mRNA
( X9 ~; N# l+ H3 xNCBI Reference Sequence: NM_207681.2; N) I  {& ]( E. B! Z. w/ T

0 ^) J* d+ C5 K" ~" ~: s$ E% wBcl2是Mus musculus B cell leukemia/lymphoma 2 (Bcl2), transcript variant 2, mRNA
- g5 V, q7 y* M8 uNCBI Reference Sequence: NM_177410.2- Y3 ^, K" S* a3 v' _" z1 u
! y5 [6 j* n4 a/ ?/ d* k% H& o) A
Bax是Mus musculus BCL2-associated X protein (Bax), mRNA3 b& z$ \7 R; U
NCBI Reference Sequence: NM_007527.3% B: R- t; g$ I2 N9 E! X
2 L5 W! e) b5 _- b
另外，图中Bclx和Bax标反了，不好意思~) w& t+ \3 q) e$ @6 ^0 t0 E
所以，您能否提供一些更好的基因来检测是否有凋亡的迹象呢？5 ^: b: B# j9 L, R

jiojoo

回复 希望之光 的帖子: @; p; {" \, m( a. f$ m9 F  L
! _7 c* Z, m5 c( H1 w1 w  J% [
感谢回复，因为我并不是做凋亡这一块的，凋亡相关的东东完全不懂。# X7 o; U  P1 R- e" [5 A
我只是看到其中一个组细胞7d之后都死光了，所以就想看下是因为坏死还是凋亡，另外，因为现在的样品还有cDNA，所以就只是想做个初步的实验来大概地判断一下
1 A. r* o9 i3 O+ e* @' _1 B另外，图中Bclx和Bax标反了，不好意思~
9 f9 t" R; F) M4 |1 ?另外，您能否提供一些更好的基因来检测是否有凋亡的迹象呢？& c. u$ P( S* |3 U