怎么通过基因表达来检测细胞凋亡？Fas和Bcl2，bax，BclX能不能检测？

jiojoo

% G  H3 b! J- L9 p3 o1 i, T; j3 [& A& v! G
因为样品已经没有了，只是还有cDNA样品，想顺便检测下细胞的凋亡情况，所以就定了几条引物跑了个qPCR, c3 O. L' w' V% [1 Z$ A
结果如下图
8 f+ ?$ l/ V& h3 ^/ RB组是对照，三个处理组，分别是D组、F组和H组，3d和5d两个时间点
# e% t+ [! F1 D! K( h" ^

2012-7-17 23:37 上传

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, l8 Y' S; {: B  C这张图片能不能说明一些凋亡情况的？
: p3 e' B( m( V8 U或者需要做哪些基因才比较好？9 |3 w7 Q9 P# O! r2 Z
期待大侠的意见，非常感谢！

yuhaoze

Fas是受体吗？ CD95R？: M1 q, Z( G* A$ s
我看其他三种都是信号通路下游的一些凋亡因子，可不可以检测caspase呢？
: y2 p0 _: I9 l* I8 w3 S不知道你研究的是那一块儿，但要是想检测凋亡的话，通常情况下是western检测活性的caspase8/10/3/9等等! |* i$ {, \# L% ]

希望之光

凋亡相关的基因有很多，首先你选择的这几个是不是和你的实验目的相关，单凭图中的数据来讲，并未发生凋亡，或者说个别的根本就没凋亡。再看看相对表达量也不高所以呢建议楼主再仔细琢磨一下

妖妖空

我们可以好好交流一下的，我最近在做的是过氧化氢诱导的HL-60细胞的细胞凋亡的实验，也是第一次做这方面的实验，昨天96孔的板刚刚给药，今天先大致检查一下细胞形态，做下荧光染色，看下凋亡小体等的情况，做个DNA电泳，看下DNALadder。最后检测一些较明显凋亡细胞的细胞膜外侧的磷脂酰丝氨酸（ps）的含量，请问这样做初步筛选来确定能引起凋亡的浓度范围，行不行。谢谢指导。

妖妖空

回复 yuhaoze 的帖子, N7 [" A) Y! R3 Y: u
  V; `9 X2 l. {
一般检测caspase的时候，起始caspase和效应caspase都要检测吗？通过特殊的caspase检测能确定凋亡是内源途径还是外源途径吗？

妖妖空

回复 yuhaoze 的帖子
: O8 P( W+ @4 U( R6 L! k6 ]' R* ]& @& b0 [. h) ]
Fas是外源途径中的受体，它的配体是Fasl。Bcl2家族对凋亡有抑制作用，其他两个蛋白家族对凋亡都是促进作用。

yuhaoze

. ^/ q1 e& t. r
: K3 g, F+ v. I: b8 |+ \
检测那三个是一个anti两个pro，如果检测受体的话你就默认了那是fas外源性通路，但是外源性通路受体至少有4个。我这里有三个想法：
' k7 O& y3 ~/ S* |/ ^! Z* G' F1.这个要看哪个快，一般如果在凋亡一开始就能检测到大量活性的caspase8/10，而细胞色素C和caspase3滞后的话，那很可能就是外源性途径。通常的作法也就是检测3个 caspase 8、10、3， 再多了也没有意义。
, Y+ A" e# [0 F; F; [. s. E2.个人认为（因为有将近1年内有看这方面文献了），外源性通路和内源性通路的差别在于，capsase3和capsase8/10, 哪个是上游，哪个是下游。如果激活外源性通路，capsase3是下游，如果内源性通路caspase8是下游，我只是说一般情况，现在研究出了capsase12通路等等，就不在这个探讨的范围之内了。
; l8 K' l9 v% h根据这个判断，你可以用特异性的capsase抑制剂，来抑制其中一个，看看另一个的激活状态是否改变。举个例子，如果你抑制了caspase8,发现caspase3从大量激活状态变成了没有火星的状态，那就可以证明caspase3是下游。5 P! X/ N6 z" x4 x! L. N
3.有一个连接受体和外源性起始caspase的蛋白,FADD,在各种外源性通路中都有参与，也可以检测这个。
4 y& x, t9 G; f/ L
% U+ V4 I; ~3 ~) A$ D. t7 \' _: }! m" U& L

* F8 c  M/ ]+ R; }% W我写过一个英文的东西，可以传给，你不知道会不会对你的想法有帮助

yuhaoze

检测磷脂酰丝氨酸这一步必须要做吗？我觉得很贵，而且你前面几步已经能够说明问题了，可以直接进入通路研究了

jiojoo

回复 yuhaoze 的帖子4 ]  o3 Q, @5 n

0 D  ]) h/ \$ I$ [1 x" L/ Z; [感谢回复，因为我并不是做凋亡这一块的，凋亡相关的东东完全不懂。9 @# i+ _$ j3 W) I1 q* _/ N; c, G
我只是看到其中一个组细胞7d之后都死光了，所以就想看下是因为坏死还是凋亡，另外，因为现在的样品还有cDNA，所以就只是想做个初步的实验来大概地判断一下7 u3 |$ d/ {3 M
Fas在NCBI上的描述是Mus musculus Fas (TNF receptor superfamily member 6) (Fas), transcript variant 1, mRNA7 l2 N# U& h) b/ l, |( T3 U, U
NCBI Reference Sequence: NM_007987.2
# U+ V+ h7 p) ^$ B, N' ?( H! X! t8 j& p4 K/ B2 a  }+ k0 }# b  x
Bclx是Mus musculus BCL2-like 11 (apoptosis facilitator) (Bcl2l11), transcript variant 2, mRNA& E0 W; [" ]- }( g: t
NCBI Reference Sequence: NM_207681.24 c3 \8 U7 P) d. I% A

0 x% v8 P, W' g, \9 [) w0 ?* DBcl2是Mus musculus B cell leukemia/lymphoma 2 (Bcl2), transcript variant 2, mRNA2 l' }; R8 s( B( I; M
NCBI Reference Sequence: NM_177410.2+ s2 F  [4 P$ l" F- w
  N. A/ K" K- z& Q- j
Bax是Mus musculus BCL2-associated X protein (Bax), mRNA
1 F4 E, `3 K/ n; K- f$ JNCBI Reference Sequence: NM_007527.3/ J9 Y0 O' Z" i, X

' O- h$ F* L% t另外，图中Bclx和Bax标反了，不好意思~/ d% h" @6 O0 b( d5 k- g) C6 S. i
所以，您能否提供一些更好的基因来检测是否有凋亡的迹象呢？9 B& M5 c( B. [

jiojoo

回复 希望之光 的帖子  a5 T) G5 X2 s) s

) [  V" b7 j" X6 _$ G6 r$ X  F/ `7 k感谢回复，因为我并不是做凋亡这一块的，凋亡相关的东东完全不懂。
3 `4 W) R$ b* ]+ m: l& M我只是看到其中一个组细胞7d之后都死光了，所以就想看下是因为坏死还是凋亡，另外，因为现在的样品还有cDNA，所以就只是想做个初步的实验来大概地判断一下; Z  r0 b* @$ p! C; n, T
另外，图中Bclx和Bax标反了，不好意思~( V+ i8 W! }" u0 v9 C8 s
另外，您能否提供一些更好的基因来检测是否有凋亡的迹象呢？
* G# m4 N1 Z. N% A