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本人课题方向是EPCs用于心肌组织工程的研究，开始分离和培养骨髓来源的EPCs已经一个多月了，前后分离原代细胞4次了，可最近两次，老是出现一个令人头疼的问题。
2 ^7 P2 g! W1 i) ?3 c7 r分离和培养过程如下 ：2只150g左右的SD大鼠，取股骨和胫骨，PBS冲洗骨髓腔，得到细胞悬液后先1000rpm,5min 离心取沉淀细胞，然后PBS重悬,用Sigma的大鼠Ficoll分离液（密度：1.083）进一步分离细胞,骨髓细胞悬液与Ficoll比例1:1，再设定20°C，2000rpm,30分钟离心，离心后白膜层不是很满意，仍混有少量红细胞（可能离心机启动时温度没达到室温，就离心了）于是吸取细胞层时多吸了一点，然后PBS洗涤两次，1000rpm,10min，再用30mlEGM2-Mv培养基重悬（新买的EGM-2培养基混匀细胞因子和血清、双抗后分装，冻存于-20°C后），细胞计数为5.6*10^6/ml,分别接种到一个六孔板和10cm培养皿（一个培养皿预铺了sigma, FN)。. o* s+ z. R" }: X% y6 N' ~
本来是准备4天后首次换液，可在2天之后发现很多圆形细胞贴壁良好，已经长满，但是在200倍下看，体积很小，似乎必接种的时候还要小（估计是细胞长满后接触抑制），同时还有不少米粒样一头大一头小的细胞两两连在一起（问过师兄说可能细胞的不对称分裂，还有说可能是某种细菌），400倍下才看到细胞核。另外，还出现大量漂浮的细胞团，淡黄的颜色，于是吸掉上悬液，换新鲜培养基。观察一天后，发现贴壁的细胞又长满了，但是没有形态和体积上的变化，漂浮细胞团再次出现，再次吸掉上悬液，然后用0.1%胰酶部分消化2-min，消化下来的细胞重新接种（1:4），未消化下来细胞换新培养基继续培养，后面上述情况再次出现，再消化，前后三次，到最后细胞可能由于频繁操作，污染，然后全凋亡了视野下都是碎片。整个过程中从发现细胞长满和大量细胞团飘起，一直到到第三次消化后，细胞仍然是开始的状态仍然是开始的那种形态和大小，原代细胞养不了几天。这个问题一直想不通，考虑是白膜层不明显，接种时混有很多杂细胞或者是接种密度太大，还是污染，还请战友们多指导，共同学习！稍后再把细胞照片附上，看看到底是什么情况！ |
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发表于 2012-7-29 14:52
发表于 2012-7-29 15:33
