MEF培养

huangcong1988

之前分的MEF，状态还不错。但是冻存复苏后，细胞贴壁的很少（冻存过程我敢保证没有问题，因为我试过用棉花包着4度﹣20负80，也试过程序冻存盒），冻存液我是90%血清加10%DMSO(这个冻存液应该来说还是很奢侈的),DMSO是amersco的，血清gibco的。由于细胞贴壁少，我就试着将几瓶细胞集中到一个瓶中养，细胞长得还是很慢，满了之后我传代，发现传代以后细胞就污染了，细胞间隙里面很多小黑点，像沙子一样，我也不知道为什么，分MEF的时候细胞还是很正常的，状态也很好，而且我直接冻的是原代的，按理说细胞应该很好复苏，但是复苏后六个小时，细胞没怎么贴壁。求战友指教！PS:有一个问题就是，这几天我们培养箱二氧化碳罐有点问题，可能二氧化碳浓度不能较好保证，但是个人觉得这个是个次要因素。

wangyu

回复 huangcong1988 的帖子) M1 x6 h8 H8 T: Y7 P* ]
  F0 x/ L6 P+ g8 ~- n
你试一下，1：3：6来配的冻存液
' |9 a5 ?0 P) ]) n# r9 |9 O就是DMSO：血清：有血清的DMEM=1:3:6

huangcong1988

回复 wangyu 的帖子5 d  R0 o) A7 [  a2 F, i- Y- l
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这样能好一些吗？按理说血清浓度高，应该更好啊，之前用这个冻存液冻细胞还是很好啊

huangcong1988

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7 F7 x. Z+ M6 U' s& C. E7 |8 ~2 Q# ]
还有一个问题就是，我配的冻存液的DMSO没什么气味，一般之前我用的DMSO都是很大味道的，很刺鼻的气味，这个DMSO是新买的，amersco的，原装的，但是还很便宜，好像500ml才400块左右，不知道是不是这个问题

lily46555

原代冻存是不是还有杂细胞？

Andyhigh

可能存在的问题：1.你冻存的比例太小
# N# k1 N, Q  ~% G                            2.有个细节：应事先配好冷冻试剂，让其冷却，不能细胞、血清和DMSO一起加，对细胞有损害。另外我用的
; m( V0 q* O8 x                                                DMSO味道不是很大，味  道大的是冷冻盒里面的异丙醇。
( P# @! M+ C8 f  e                             3.我做过的原代MEF解冻后，也出现过小黑点（有些比较大，中空的），不过并不影响细胞的贴壁。具体是什么我也不知道，应该            
4 S0 V/ z! W- I                                不是问题所在。
2 d: a3 J$ M( O4 L8 r                              4.培养瓶的问题，试着换一批培养瓶试试，或者换一种细胞解冻试试。
) M& m4 k% I" V! b1 C# j. a                               5.污染可能是操作有问题。培养箱应该也是原因的一部分。
  V0 J1 Y; O9 u                              6.胎鼠取材问题：几日龄取材、MEF制作过程可能有问题。
3 u2 z+ ~" d- H, ?                              7.冷冻体系问题：我们冻存是直接-80过5h以上，在液氮保存，可以参考下。还有你冻存时间（-80）也应该考虑下6 v. c6 H5 R6 D& |9 x3 A
, b* B8 h. V6 l$ u

wenBQ

血清渗透压很大吧

184lj

你用这么高血清比例的冻存液，你解冻复苏时的media中血清浓度也要求高一些（20%），贴壁后再换到正常浓度media（10%），MEF细胞冻存密度要比普通细胞高2~3倍这样；还有可能是你解冻时的操作环节出了问题。

huangcong1988

回复 184lj 的帖子/ c: S" h% B% `

4 Y, y& H8 p. i8 C' O, E, A非常感谢，其实之后我试过，问题现在解决了，真的是复苏的时候血清浓度应该适度提高一些，我提高到15%，结果复苏就有很多活的细胞，细胞慢慢就养起来了

wshtcl

我做的时候都是按照   DMSO：血清：纯培养液=1:4:5的比例，用分级冻存盒来冻存的。复苏的时候在40℃的水浴中让其完全化开。这样做，细胞的状态挺不错的。