基因敲出小鼠囊胚基因型鉴定

zhigang6637

  最近在做基因敲除小鼠的囊胚基因型鉴定，因为前面的实验结果表明该基因敲出小鼠的纯合子是胚胎致死的，现在鉴定胚胎致死的时期。但是最近做E3.5天的小鼠胚胎的基因型的时候遇到了问题。PCR扩增总是无特异性的条带都是smear，巢式扩增也是smear。试了很多种制备小鼠胚胎的DNA模板的方法，PCR条件也摸索了很多次，但仍是不能够成功，望有做过类似实验的同学不吝赐教。我做实验的protocol如下,请各位大侠们指正：- b3 D. \/ P8 m1 }
1、用200ul PBS冲洗小鼠子宫，收集E3.5天的囊胚8 ^* Z9 e6 a5 T: @8 V, T3 `! C
2、将单个囊胚收集到PCR管中，加入5ul的DNA裂解液，（裂解液的配方是从文献上看的10mM Tris-Hcl，PH8.0，50mM Kcl ，2.5mM Mgcl2,0.45%Tween20,0.45%NP40,500ug/ml PKl临用前加入）55度孵育3h，95度20min灭火PK.4 a0 y- Y) X3 ~) c7 y; O; q
3、以上述制备好的DNA作为模板，20ul的PCR体系扩增，扩增条件如下：℃
2 K7 q3 ~, t) y% W95℃ 5min5 O) K; v, d: A8 y( S! [
95℃ 30s- V9 W( T$ |$ k( O$ N% O
62℃ 30s6 C/ K$ `' q+ {$ W! B1 J
72℃ 30s( w* `* R& h6 }' a, O) v6 T
扩增40个循环，总延伸5min， 第二轮的条件类似。扩增片段分别为300bp、400bp左右，使用的三条引物扩增。( m8 |3 }: a8 r. R3 W
我看别人文献上有的只扩增了一轮就扩的很亮了 ，但大多用巢式的方法，但是我两轮都是smear。我主要怀疑是不是我的模板制备方法不对。我一般都是5ul的DNA的模板一次性全加到20ul体系中是不是里面的未被灭火的PK对Taq酶活性有影响？或者说是灭火的时间20min太长了，破坏了DNA的完整性？或者模板制备的时候55度孵育的时间太短了，没有充分裂解囊胚？
- N8 T% c* F6 F9 W5 d请做过的大侠们赐教，感激不尽啊~