PDF电子书：《人肿瘤细胞培养》

stang198651

7 u( R" p9 x; M2 z  \
! d+ V3 o7 d) A内容简介% w# E! `" [6 x8 x* a) z% f+ G
“特殊细胞培养系列”（Culture of Specialized Cells Series）共有6册，这是其中之一。和其他6册一样，本书旨在为特殊细胞类型的培养提供切实的帮助。一如既往，本书的目标是提供作者所在实验室经过试行的和已建立的方法，这些方法还与其他方法进行了比较，并补充了有关应用的信息，其中有些是作者从自己研究中新创建的。
: t8 K# G# N- l/ a# S' i* f本书重点在于肿瘤细胞，提供了详尽的、一步一步的操作方案，并列出必需的试剂以及试剂和溶液的制备步骤。为了避免不必要的重复，在正文的有关描述之后不给出供应商名录，但在每章之末的“材料来源”一览表中有这些信息，并在本书附录中提供详细的供应商名录。第一次引用的缩写词有其解释，但在本书开始有全部的缩写词表译本将“缩写词表”置于书后。――译者注。我们沿用本系列早期版本中的一些常规用语，如组织培养级的用水不论其制备的方法如何，统称为UPW（超纯水之意）；缩写词PBSA指的是无Ca2+和Mg2+的Dulbecco磷酸盐缓冲液，基于这一概念，缩写词PBS则表示完全配方缓冲液。 7 C- {: S3 |1 u! t
编者意识到在本书中并未能涵盖其他多种类型的肿瘤――欲达此目的，非得有数卷不可。编者只能集中于人肿瘤，以它们作为与基因表达和生长调控异常以及潜在治疗模式研究的最为相关的模型。编者并不想进行全面阐述，只是提供最常见肿瘤类型的操作方案，以期可满足绝大多数相关人员的需要，此外，只需要做小小的变动，这些方案就可以成为其他肿瘤细胞培养方法的操作基础。读者也可参考本系列已出版的其他书，如R I Freshney和M G Freshney（2003）主编的《上皮细胞培养》（第2版），该书介绍了数种不同类型正常上皮细胞的操作方案；还可参考John RWMasters和Bernard Palsson主编的由Dordrecht，Kluwer Academic Publishers出版的《人细胞培养》第1卷和第2卷（1999），其中有有关培养的人肿瘤细胞系较全面的评述。 : x+ H5 ^" J# G% Y9 ?1 E
我们感激所有的撰稿人，他们为本书提供了自己的专业知识，花费了宝贵的时间来准备这些详尽的操作方案，并对他们各自研究领域其他人的工作进行了综述。
. ^& E1 i6 Y1 a" X6 Y; h7 K' oRoswitha Pfragner $ |) ]/ F" d$ B, m
RIan Freshney * W* S7 e+ V4 ?% T
（章静波译）
* s( V3 M/ _9 v. t原著作者名录5 a" R1 C6 N$ Q; t+ d4 P& h

8 U" f# \0 r% Q8 Z3 ~. J
2 x+ W6 [. o! i( C2 V- V目录:: {  E; e, R* @5 u- E+ S
第1章培养中的人肺肿瘤细胞的生长1 ( A0 b7 G  a1 D
1引言1
+ f+ o# v& h1 E. i" Z11细胞培养及肺癌发生1 . J& J. o. ]8 S8 R% e
12肺癌细胞生长所需的生长因子和激素2
% d6 c6 R- e5 P  I  F5 C4 P2培养基及试剂的配制4
& x3 M# n8 ~0 A2 U$ v+ i21HITES基础培养基的配制5
$ c6 q' S9 r( }$ e6 _- {3 T$ W22C培养基和C改良培养基的配制6 . ?% s( Y, N  P) P8 K% w
3安全提示7
- W2 Z, h3 H# }. l, D4 U4操作步骤7 + W* C5 J: l& t6 X& }3 B
41取材及运送7 0 h$ B3 q/ V) ~5 _; n
方案11肺肿瘤标本的处理7 * H/ m: L& ], Y4 ?
42细胞分离7 2 X: j9 Q" x- A- Q
方案12机械研磨法从肺肿瘤组织收集细胞8 ! T( A& H1 M" U' D0 O6 [; i
方案13用胶原酶解离肺肿瘤组织8 ; A; V! W# D) _, y+ g: {8 X
43细胞培养的条件9 4 C$ c# Z  |3 {5 \. K3 t
方案14SCLC细胞的培养9
/ x6 ~' F" k6 o; k0 |, j( v3 v方案15来源于腺癌和大细胞癌的肿瘤细胞的培养10
0 h7 T. M2 U$ S4 |7 l3 C. ^方案16肺癌细胞的克隆化培养11
8 L; Y. O" Q5 M2 C2 A; _- `; B44致瘤性及分化功能的分析12
$ d' Z( ]4 M7 V$ H1 T8 ~8 W45其他方法12 . v) F) D% J/ P0 i. q
5讨论13
6 K6 w- }/ r+ t6 ]1 W致谢14 6 Z* r1 n# ]! M+ [. N
材料来源14
$ a, m9 J# R3 O' {$ r' a' ?- J! }2 `参考文献15第2章正常及恶性胃上皮的培养17 1 k  q" Z  J/ h9 u/ H2 E
1引言17 / z# E% T& q  N0 O, o
11胃癌17
0 G! n% B5 Q& f3 M: L+ A12正常胃上皮18
9 @5 l/ Z  \. C2胃癌组织原代培养的准备19 7 v0 d! J. c% ~6 [: j3 \( m+ I
21生长培养基19
3 r* c  `! g3 T2 t22起始培养基19 1 U+ l4 j' D4 Y
23肿瘤标本的预处理19
! D( e1 ^$ G7 r5 D" R3胃癌细胞的原代培养19
  Y4 B  a0 r+ y0 p2 d8 X# h6 S31实体瘤的培养程序19 % w9 f: S# ?9 I6 ?7 }
方案21实体胃癌细胞原代培养的准备20 ( f, X3 g$ u8 i  }* _7 q; h
32腹水培养程序21 - w; Q7 Q' v& p& p7 S6 T# K
方案22密度梯度离心从腹水中分离胃癌细胞21 - J' w3 l6 g9 A! L! n; P* D! x
4癌细胞的富集21 ( {1 _; t& e5 V' @: r
41悬浮细胞团22 % m" Z" F  n7 ?4 T) `$ G$ |
方案23移出细胞团，富集癌细胞22 8 p% j4 @! p  W& N0 m5 A
42黏附性集落22 % l2 F; y8 h9 h! R
方案24用机械法使细胞聚集体脱壁富集胃癌细胞22
. m% {+ |* A- z6 [0 y4 Q方案25刮除法富集胃癌细胞23 . `* Z" z) c. U, {6 b0 n
方案26分步消化法富集胃癌细胞24 6 A! k, D7 s, h4 f$ c1 l% B
5癌来源细胞的扩增和保存24 / ]4 f9 |: t! G0 [
51漂浮细胞聚集体25
$ L4 f3 X' y( J4 o- u8 |9 _  _52紧密聚集的细胞团25 + I7 d' Z6 [  F& Y+ G
方案27分散细胞聚集体，传代培养胃癌细胞25
$ d9 o8 }+ N0 \3 n0 `0 v, Q3 h6 \( K53贴壁细胞26 5 W! F" y" q+ {/ r
方案28贴壁胃癌细胞的传代培养27
* _" b1 T* X0 }# f, h54含有贴壁细胞和悬浮细胞亚群的培养物27
( S( _' r, @2 h( \3 T4 u% A方案29混合有悬浮胃癌细胞亚群和贴壁胃癌细胞亚群的传代培养27
9 U( h( Y/ v' U' X( c4 q- H2 p6培养的胃癌细胞系的代表性特征28 % G' e8 g. M* t  I) ^2 v
7国际细胞库中的胃癌细胞系30
9 e3 Q5 C4 g( `, n( M8 y8正常胃上皮细胞30
* p: F( d+ B. t1 s3 x6 X81设备、试剂、培养基制备30
; E; G2 f7 K/ G0 V- u8 }) p/ k82组织的获取及安全34
% b6 x4 v9 t0 `! H+ Z0 k( e83人体胃黏膜细胞分离和培养35 9 x/ a$ K1 Q& Q+ l& E  z" F1 S
方案210用胶原酶消化和Percoll分离细胞的方法原代培养人胃黏膜
7 M( F5 n& ?+ z; T) g& |4 c上皮细胞35
1 z0 E9 C/ b& v方案211利用胶原酶/离散蛋白酶消化，在胶原上接种原代培养人胃
/ J5 K5 ~. H, s7 T黏膜上皮细胞36
/ u0 @( o8 J2 y9 Y6 A' ^) |0 S0 D9 t方案212利用胶原酶、链霉蛋白酶、透明质酸酶原代培养胃黏膜上皮 ) R" p' n1 O, G! m7 ?
细胞37 2 L# y7 n! ]9 i- C) m
84人胚胎胃细胞的分离和培养39
0 U8 E2 Z+ c; |" t2 W方案213人胚胎胃细胞的培养39
* r  ]9 [/ U" @: I85人胃窦细胞的分离和培养39 7 d# R( O1 ?+ j: O- l
方案214人胃窦细胞的分离和培养39
" d! |+ I4 G8 f5 l86胃黏膜细胞培养物的鉴定41
/ ?. X/ _. W# c" f; {2 W" U+ U1 V方案215体外胃上皮细胞生长测定41
: R0 V9 ?8 u% {# p方案216PAS细胞化学鉴定黏蛋白42
8 Z0 j4 _8 |* p3 E, V! D) f  ]; q方案217胃细胞黏液的免疫组织化学42 + q/ O6 C: Z7 X7 _
方案218通过细胞角蛋白染色确认胃细胞43
$ Y& R5 _4 g2 w- X% n5 C& _) H5 V方案219用抗胃蛋白酶Ⅱ和胃H＋/K＋ATP酶免疫荧光鉴定胃细胞 ) L4 ?3 N' c' g$ ]7 Q) n& \4 j4 W
类型43
( b% y' U- C( a# ~, v% L方案220胃上皮培养物的光镜观察44 % a( m9 |! ~% X- k. Q" c
方案221胃上皮培养物的电镜观察45 7 A* M. _& U0 I- p/ v
87正常胃上皮培养物的主要应用46 9 O  B& |' I& s, k4 w
致谢46
4 I& d5 ]7 D+ x2 k3 ], E* N: B3 h材料来源47
# P" Q8 Q6 s  H8 p% g$ `参考文献48第3章结肠癌细胞系的建立51 4 ~  q; z& ^8 i1 b% g! o4 h& {
1引言51 $ q- S& {/ h. a7 x7 ]3 ~( ~) E; z" @
2培养基及试剂的配制52
2 O% r. s5 U) v- u" \) L& o4 ^21培养基52
# Z1 C* {9 ]" Z0 _9 e/ ^22消化酶53 ) Y* Y( }9 J( b
23消毒液53 $ D# z, L1 H/ v
24包被胶原54 9 m* }2 x9 J, u1 K- O
方案31包被Ⅰ型胶原用于结肠癌细胞的培养54 3 X5 e$ e; G/ @$ i! H4 \& ^3 w9 w
3用肿瘤活检标本建立细胞系54
7 P7 b( i3 }  Y$ u9 B2 m31原代培养55
/ \9 Y, T" L! ]7 B) {4 w! \: s方案32结肠癌肿瘤组织的原代培养55
) {, y- L. ^( k0 q2 \% y1 ~32传代培养56 0 D9 v0 s, r4 |3 x
33细胞的冷冻保存56
( e8 e$ t2 x: y34特性鉴定57
  V6 E, T- w9 G7 D, V7 x- d4取材自腹水的细胞培养58
3 b. P! ]6 H$ ]% e# l2 ?方案33来自腹水的结肠癌细胞的培养58 " y& T. ^# _9 r0 T
5其他方法58 ( X) F0 C; x& F( v  k
51饲养层细胞58
) h' \& e- h' L1 g52异种移植59
( Q( h5 P& n* B7 B% u- t) S53取材自遗传综合征患者的结肠癌细胞的培养59
+ ]* B0 S0 p6 m6 d2 b6供应商59
6 `# v5 o2 n2 @61培养用塑料器皿59 , T: u' k# Y! B' q$ a
62培养基59
3 m0 D+ H& v  J) {# p, ?材料来源59 ; ?- L: @3 z4 A+ p3 f/ I
参考文献60第4章胰腺癌来源的培养细胞：基因改变的研究及在实验性胰
" ^2 b" n1 J2 A( a腺癌转移模型中的应用63
& F" @* L/ c. t' W& z4 w- m1引言63 1 o, ~# N' L' |3 W5 h
2细胞系的建立64
  v8 l/ I  _, t0 M21肿瘤组织的来源64
6 k/ w# x* @' A! s22原代培养64
- L; I0 \) t0 h9 b9 S3 A* g方案41胰腺肿瘤组织的原代培养64 & E* J6 o  s: c: }
方案42来源于腹水的胰腺肿瘤细胞的原代培养66
* l9 {: Q! ^+ G- H1 d3肝转移实验67
& C9 e2 d4 T$ ~- s$ @5 M/ ^方案 43裸鼠异种移植肿瘤转移实验67 5 ~( S" I, Y( G
31肿瘤转移分析结果68 0 D; \7 ]! {' o- J
4人胰腺癌原位移植模型69
% r* _7 d( A$ C6 |41手术过程69 5 j7 U. I: j, ~, K+ s$ t
方案44胰腺癌细胞系的原位移植69
3 X: S; S' z: z42裸鼠胰腺癌细胞原位移植后的自然病程69 + f* g* ]! A7 }% T; d" P
43移植肿瘤的肉眼观察70
# j& E: K, ?1 u44移植肿瘤的显微观察70 . J& y) i0 |4 q1 x. z/ U
5基因改变71
9 K% K7 i0 y2 C' V9 h0 m51Kiras基因突变（密码子12）71 " v( z3 ^* V1 F5 \" \! \* D6 P
52p53基因突变71 8 B% o, p! j: b- d% d/ _
53CDKN2A基因的改变71
2 [6 Z' c! B& m  E' e- d( u54基因研究的结果72 9 ?/ a( \, ~" i6 N5 P
材料来源73
4 F+ N6 Z9 a# B( A, A& A- c参考文献74第5章体外膀胱癌培养的建立和鉴定75
: R" P+ U& r- J1引言75 2 U. q  A. I/ _. G! u/ C) `/ S4 @% `" E
11背景75
( n5 t" V5 ?5 Y( n2 Z12病理学75 1 c3 g/ }; {7 o) \
13方法原理76
  o, F4 ?, m; q  q( b  M% F2培养基和试剂的准备77 " R6 i) ^/ E6 c8 u
21培养基和盐溶液77 # I5 }/ t, x* L: z1 j& w, d
22胶原包被培养板78
6 ^% b7 e8 |$ A" [方案51从鼠尾提取胶原78
* ~1 `) S5 d  f4 r5 n7 `6 U方案52氨重建胶原凝胶底物79 ; @" S7 M* b8 A
3安全提示80 0 ^0 y- T7 Y! \- I- P
4培养80
. Q6 f8 @5 D' p% Y4 U1 A41组织的获取80
% O  i! W/ S) r1 b42原代培养80 * b) E" N  a; x
方案53膀胱肿瘤原代培养80   t8 c9 w* m6 y" g: b
43TCC的传代培养81 - S" t) U3 ]# i. @  s: y
方案54原代培养膀胱肿瘤的传代培养81
3 @7 y2 {: S, n3 B, d5 |44细胞的冷冻和复苏82
4 I7 x7 u. D8 R7 ~3 o* L5转化状态建立的标准82 2 U* [) z+ A* w' ?+ F+ z" h
6常见问题的处理83
) V3 u4 c( X. Y6 S/ e61细菌和真菌污染83
  }# a# t* [! o: ^" o62成纤维细胞污染/生长羸弱84
: N) Z) x& m% q# l$ R7 g1 h63分化84
( F/ D# @- L+ k9 U: L4 C7方法应用85 2 @# `# d. C( R  B* a
8其他方法学87 & T5 _  |0 w7 w
81胶原酶消化87 0 e8 W  g" \# c" S! E( y
方案55胶原酶消化膀胱肿瘤87 . V) C& ~! ?8 A/ w3 d
82单细胞悬浮培养和其他培养技术88 5 D& i5 X! R; V7 G8 O
83其他要求88
# R2 G, W3 `! ~2 ~+ m9可供使用的持续性细胞系目录88 ! G$ E) o8 E$ N9 c  s  }8 K" |
致谢91 + \# ^/ J+ Y) g3 f% d3 o+ Y+ w" w
材料来源91 4 j$ q! P: s0 \9 @2 B( \0 \
参考文献91第6章正常及恶变人前列腺上皮细胞的长期培养97
! O5 Z* T; \* }) b; V1引言97
1 q8 P7 [' a3 o9 ~$ h( S2制备培养基99
) X2 q- c5 w! h+ r" _3获取组织100 / t0 [9 p. |% u& o- c
4处理组织100 % Q# Q8 _, t: V) m8 Q
5原代细胞培养的建立101
. w) ]: M7 U4 {7 b方案61正常、良性及恶性前列腺的原代培养101 * ~) B8 r/ E' c
6原代培养的维持102 * k/ J) |* _3 v3 h, \# e# `* W
7原代细胞培养的永生化103 8 o5 R% o* T* E; q6 \% v
方案62前列腺上皮细胞培养的永生化104
7 ^7 [1 Y5 p, r' v71安全提示104
& ]) a+ @0 e- W5 _2 y7 V8稳定细胞系的特性105 & s9 C4 t, f. f& z" a8 C+ @
81杂合缺失的检测105
1 Q  P/ I1 e3 v( p! X方案63前列腺细胞系杂合缺失的检测105
8 e: F5 b% u3 d. \9稳定细胞系的维持106 1 @" G5 G" |8 z* }. z2 N: H4 Z
方案64长期前列腺细胞系的维持106 % M: h5 M- f4 z2 J# |4 ~
10稳定细胞系的冻存107 4 V% F( h* a, C/ E2 r, b& d
方案65永生化前列腺细胞系的冻存107
3 \  A7 z' b2 ~- r! K方案66冻存前列腺细胞系的复苏108
) [) r2 D7 Y1 _0 T' ~  C; H$ O11应用108
3 M; V5 O7 r1 ^' n: i: `致谢109 3 y0 c2 ]$ w. d1 {9 M6 q
材料来源109
' J5 ]& j5 o; c  A9 D参考文献110第7章以实体瘤和腹水建立人卵巢上皮肿瘤细胞系113
, v  T. n! i( T1引言113   q8 h% V6 A3 i7 _+ N  H4 q
11胚胎学和组织学113
- a/ l. F, H: x2 ^) P12卵巢肿瘤的病理学和病因学115
7 Y. }7 ~1 U/ g8 G9 D! b/ S+ u+ t13卵巢癌的临床特征115
! D8 }% m6 \* ]! K  |14卵巢肿瘤细胞培养和细胞系建立的概述116 : c+ `2 s5 C- A3 ], I, g
2培养基和试剂的准备117 ! B  C8 }- B% Z/ }0 O( l
21培养基PPIGSS117
: |4 r* V4 i- H7 s+ o" j22双倍浓度的Dulbecco’s培养基2×DMEM117 8 }" {$ J% V: Z7 t# M
23CMF117 & ^+ p* `; r' h/ y/ n( ^6 d
24胰蛋白酶117 . }% q# _! J; M) V( E' X  t3 C, j
25胰蛋白酶/EDTA117 $ M( w9 ], |2 B" L% P( c3 _! x
26DNase118 . ]# ?1 a& W4 i2 U$ v0 e
27CFA118 * w$ {, V& t* q# a! q
3肿瘤的收集118
/ E: {6 L  H+ b$ h, ?31伦理许可118
0 D/ U' \4 I/ j& d32收集体系118 & n* G! _: j! N2 e% t
33从手术室收集实体瘤和腹水118
5 J. ^" }$ A5 w0 S方案71卵巢肿瘤样品的收集119
% G! v( K! `: G8 W* l34病理学报告剖析120
8 J5 {, }6 h" m2 C" R8 [4原代培养121 & r/ V! N% K: F# L
41实体瘤的破碎121 . M7 v9 I: E. _: B2 z: `# {; \
方案72卵巢肿瘤的机械破碎122 % z- d" b5 ]3 A# x
方案73卵巢肿瘤的冷胰蛋白酶酶解破碎123 5 H8 p7 P' R1 g/ y/ D) c
42去除血红细胞124
0 _/ r  l3 j8 n5 k方案74渗透压脉冲（快速吹吸裂解）去除血红细胞124
' g( Q3 n" i( C3 Q; k/ R2 d方案75密度离心去除血红细胞124 $ K4 c, h6 e) v( K0 ]2 v" \* u7 d
43原代培养的起始125 9 I1 ~8 ^8 d* i. [$ W) {2 `
方案76卵巢肿瘤细胞的原代培养125 - u2 N- }3 b! J- d
方案77腹水来源的卵巢癌细胞培养126
; T; `' |3 ~0 C6 x  ~& o5原代培养的后续工作126 - a/ Q( k* ]1 }, N8 I! @
51细胞分离127
, o+ A) u- ]* V; ^方案78用差别酶处理（DET）从混合细胞型黏附培养物中分离细胞127
/ J0 i/ T( K8 }. B" N, z52与DET组合的无细胞腹水（CFA）的利用128
" m; d9 x) z7 c3 Z4 u4 [方案79利用单层间皮细胞选择适合于上皮间质分离的腹水129
- J5 O# |( r8 w# K方案710从CFA和DET的混合单层细胞中分离卵巢肿瘤细胞130
3 {/ ^1 ?6 h2 [6传代培养131 ; P8 [3 I2 ~  {
7培养中的细胞鉴定133 6 c" \. q1 h# B5 D% m. K2 w
材料来源136 ) h2 _& G; r, N& a: W1 y
参考文献136第8章宫颈癌癌细胞系的培养139
% I; K% Q5 [3 h' I. p) B1引言139 9 G8 A0 b' c0 u) ]( [2 L3 i) s
2安全注意事项140
4 ~4 {$ C! f& O3培养基及试剂的配制141
1 `3 K: s0 d3 _6 `31破碎试剂141
( C4 _1 |; C2 G' z& Z, y& \32培养基141
6 ^3 e4 x& d  V5 ]. h% h33台盼蓝142 4 T9 ?% t7 ~4 i& |% }
34琼脂克隆试剂142
# O! L, r* z* J( j% V8 O6 _2 q% @4 G5 w4短期培养的建立143
9 F5 ]6 t, g: `( ?) L8 f) ^! X- t方案81宫颈瘤细胞悬液的制备143 3 u3 H7 }" s$ t) A
方案82宫颈瘤细胞的软琼脂分析145 0 V3 b( v# B. Y# D
41短期培养物的应用146 . t# J2 ~4 B  U/ E5 r: D  g
5长期培养的建立146 + @5 d& l4 _; D
方案833T3饲养细胞层的生成146 - ~5 N/ }& r0 d, r% v3 t4 \
方案84宫颈瘤原代培养的建立147
1 _* a2 u( p$ H5 R9 Q方案85宫颈瘤细胞的传代培养148 * ~+ {( i- v% V) I' a
51冷藏149
+ L6 D/ _+ v6 _0 P# L/ M" z* e52建立长期细胞系的其他方法149
; Q- A; H1 ^; n53肿瘤细胞系的特征149 . X0 S) w- x# q9 G5 g7 h2 D) r4 V) ]
6长期培养物的应用152 : \( A5 d2 o  g
7结论155 ( }: Q; ~+ g% }0 j3 D
材料来源156
3 k4 i% y, C. i  E5 N% `" V参考文献156第9章人类乳腺肿瘤细胞的原代培养159
  B# b# u! u" H" D1引言159 % Y4 D# t; W+ O+ m; O
11乳腺癌模型：细胞系159 : f/ d% t; s# o1 k0 }* S- @/ ^; I- K0 f
12乳腺癌模型：原代培养细胞159
, P, |* M8 L0 Y) W2培养基及试剂的配制160
4 B7 D/ Z! z/ D9 ?& e# j21抗生素溶液（ABCPBSA）160
6 A6 D' P* P- l0 R& j22器官样培养基（OM）160 ) j" ^1 l% w4 H) k! s, ^
23收集培养基160
0 i2 L5 P2 i5 x: h$ G24原代培养基160
# J5 D% d6 A& G3 n$ e! Z0 V25完全培养基160
7 P' P( {  r- p7 c26Tris缓冲盐溶液（TBS）160
) n% b' C0 c! O+ q3乳腺肿瘤细胞的培养161
& l5 k4 w0 P6 _+ q方案91胶原酶分散乳腺肿瘤组织161
' G5 C# q! L3 j/ a- c! I方案92已解离的乳腺肿瘤细胞的培养162 # J9 J9 E$ x2 d" \
4鉴定163 5 Z4 e" m# [, U" |
41培养物表型的确定163
9 X  u/ n% ?4 ]; N: Q方案93免疫染色确定培养乳腺细胞的表型163 6 ^3 i6 D+ Y( b9 z; u  j
42流式细胞分析165 0 @! Q9 m6 \0 x$ a) ^# q5 `+ C
方案94乳腺细胞培养物的流式细胞分析165
2 P. `; \9 ?  Z- C43生长控制165
/ D! [6 K2 r) v" ?5乳腺癌细胞模型的应用167 2 b  Y/ E- d2 Y5 b
致谢168
! F8 d: \; k1 o4 U, ], h- S材料来源168
% b* G. G4 j1 O参考文献168第10章肌上皮细胞：培养和研究方法171 ' k# S3 h! Y/ P: Q
1引言171 6 o/ f( e) s* E$ H
2肌上皮细胞的研究172
+ Y7 Z+ q% M7 _2 V% \8 t3肿瘤侵袭的抑制173
( }& ?% L8 k5 q4 B4肿瘤血管发生的抑制181 ) P8 f' B. d, j; P# U
5生理学和药理学操作188
/ z0 |$ c7 D  \/ r6肌上皮细胞基因产物作为代理终点标记物188 $ t8 M: u7 L" h' G7 @! J4 @* U
7转化的肌上皮细胞189 7 G3 L5 h+ |; p5 M) b" k4 K
8培养基及试剂的配制190 - C  a( w2 L: g' D' K6 i3 d
81补充的KSFM190
, _, Q3 F. f3 g8 q82贴壁培养基190
" \3 e1 y6 c# m83CMFHBSS190   Z- _/ Y3 ?2 V: w
84破碎培养基190 2 a! U4 J, x( m& i0 i6 D, A4 W
85胰蛋白酶EDTA190 ( T0 j: Y3 U8 s* F5 ?
86F12/DMEM/H190
2 t! N# l) B9 F  p7 r4 I87解离酶培养基190 & q& y: Q$ R+ H- ]# z/ u: n6 C
88无血清F12/DMEM/H190 1 c$ V( r2 {$ v2 u% w
89高盐缓冲液190 $ C) B4 B; S/ e1 h: i
810尿素/盐酸胍提取缓冲液190 $ b8 f( b7 V) |. R. f7 i
811Tris缓冲盐（TBS）191 ) j' _) i' P. R" X, Z
9转化的和正常的人肌上皮细胞培养191
! P# w/ ^$ O8 W9 T: h91转化的肌上皮细胞191
+ d6 k( @# B- v6 |$ @/ |/ R方案101转化的人肌上皮细胞培养191
7 U: Q& ?  K" @+ C92正常的肌上皮细胞192 : w' K, k; {3 i
方案102正常的人肌上皮细胞培养193 9 ?9 R/ Q* |- K8 _8 h
93复苏和特征描述194 : G& p2 |& {7 \
10肌上皮细胞基质的获取方法196 3 C% h2 I: _' t' ]; O+ M. R' ^
方案103人肌上皮细胞基质的制备196 8 q+ ]5 ^3 B1 F& M8 A* H( e/ J
11未来肌上皮细胞研究的方向198 4 v2 H8 m1 s6 S" ^+ n2 ?2 x
材料来源199 ; j  ^. ^$ V2 s* E6 K' G* J3 q
参考文献199第11章多阶段头颈部鳞状上皮细胞癌201
2 Z3 L: b4 B4 ^: [. z7 p4 M* J. C1引言201
5 R6 J0 h$ ~* @* v% P3 k$ c0 |2培养基和试剂的制备202 . u$ V* k* g6 j5 w
21生长培养基202
+ p" o% l- w/ q  y: m1 A22胰蛋白酶/EDTA203 2 E: N3 {( [% h! I! _# v8 X8 X
23经辐射过的3T3（X3T3）细胞饲养层的制备203
$ H1 n" m# ~, z' m  i; ?, O3肿瘤样品的采集、分期和病理学203
2 `( d. J# w" Y) S. B5 I4来自SCCHN和黏膜红斑的细胞培养物204 & T9 I& B) {, t
方案111头颈部鳞状细胞癌的外植块培养204 ! e  I" {1 l+ D# a# u
方案112SCCHN细胞的传代培养205 & O' a1 u1 O6 e0 \/ c3 x9 B0 A
方案113黏膜红斑活检组织的冷胰蛋白酶消化法205 . ?. L8 ^; {' v" |* D0 {2 ~3 l8 g3 I
5培养物的特征206
  H$ E( R4 O6 _2 l2 A7 m* C51鉴定角质形成细胞206
2 ]8 R0 H9 o  E52透射电镜206
. |: x- }2 v, @" t方案114单层角质形成细胞的透射电镜观察206
, B6 d0 [, J" |53角质形成细胞瘤、相应患者淋巴细胞和成纤维细胞的DNA指纹分析208
" w/ U0 g! {+ Q; e54从正常、癌前和恶性鳞状上皮分离的角质形成细胞的增殖能力209
, B' n- i, n$ L) y7 X. z方案115角质形成细胞在琼脂中的克隆生长209
. B& f9 q& D* G: U/ v55癌前和恶性人类角质形成细胞缺乏对终末成熟信号的反应212
. T8 x! S) M: Z方案116角质形成细胞终末成熟分析213 1 z' K! _9 H6 ~. G
56癌前和恶性人类角质形成细胞的致瘤性214 4 w0 K6 G! v' V# l/ C1 Q
方案117在裸鼠上的致瘤性214 , n/ A. K' G; Q1 u  B; o# ~
57细胞遗传学215 ( y# u$ h8 z" t+ M6 j1 n
方案118癌前和恶性人类角质形成细胞的染色体分析215
3 ^: B/ s+ Q; J6讨论和应用216
3 D: v1 z3 U( L% T: E% N致谢220 6 ]; s. y2 N0 P1 k% N
材料来源220
. [' W0 I1 G9 V( E3 X7 ~参考文献220第12章正常、良性及恶性黑素细胞的培养225 : K; A4 o; S, @7 `% K; O
1引言225 ' G) W, L* o" H7 a
11单纯正常黑素细胞的培养225
+ }( p1 f5 k1 q0 x8 i  v12痣、原发病变和晚期病变来源的黑素细胞231
% Y$ }$ F8 L4 J) |13黑素细胞起源的确定233 - j, e! I( a/ ]8 Y* I
2储存液及培养基的制备233 7 q, _0 u# ]1 K. M
21储存液233
( a5 C7 c. P7 B22培养基的配制235 " Y1 c2 H8 U) H9 |0 f% g/ g. R
23组织准备236
. z. a5 _7 {) Q5 e. E/ C方案121正常人包皮的中性蛋白酶消化236
( {9 H. o' F3 |  F; {方案122人包皮的胰蛋白酶消化237 , n( o8 J, k  A
方案123来源于痣及原发黑素瘤的黑素细胞培养238 : z- J: X$ A9 B/ o7 u
方案124来源于晚期病变的黑素细胞培养239 # h" Q% z2 a  g. j3 {
方案125新霉素（Geneticin,G418)处理去除成纤维细胞239 8 W% |- A2 X" U, C$ ^( i
方案126黑素细胞维持培养239
% H/ B( K0 z& w5 c+ x24培养方法的变化240   _9 I: Q# ?" k' j8 `
3安全提示240
* E* B; @) X$ [3 N. w1 \$ N4主要应用241 0 c& S0 P: _" e$ o) Y5 y
41基因变异241 ' |# q( [  ?* C( \% ?
42信号转导和自主生长241 ' T& K/ B) G. z* F9 K2 f6 N8 \
43恶性肿瘤进展的体内和体外模型241 3 j; S. ^8 q; k7 e! \
44黑素瘤疫苗242
6 K! |, K1 c' D; n. @45移植242 ! Z9 j) L) _0 F* r5 I
致谢242
! m2 ^6 M% d; K9 F* M) g$ Y3 O! G材料来源242
; s% l& D. b( `  ], q0 Y参考文献243第13章人类白血病淋巴瘤细胞系的建立和培养251
) v: \; }+ G9 x; @- t4 V( {0 Z1 N1引言251
8 N* O4 r6 I& q( c& {$ b9 j11背景251
( Q8 ]4 g: F! Z2 K( d8 i7 n4 c6 `12方法学原理252 . `; e4 L) U7 @: D4 Q4 G- E' Y$ E
2培养基及试剂的配制254
4 d0 I9 b8 @9 V- m21培养基254
( f6 o# h0 s7 ~( b# |5 V- |( Y22条件培养基254
0 C7 F( B0 `* `' ]2 d* R3 m方案131用5637细胞制备条件培养基255 8 e7 X3 V% T1 I" K1 N* v
3细胞系的建立255
+ Y, c, d/ \& `) G; D, |6 {6 G: l31获得细胞255
; u5 o+ U( D) d方案132收集样本用于培养白血病/淋巴瘤细胞256
! }/ T4 R/ Y3 G/ F! H3 ?- f" D32分离细胞256 " O  Q5 \# E9 C' r& ^# U; J
方案133密度梯度离心法分离单个核细胞256 5 l/ l3 Z) o7 B' N" F& b9 J
33细胞计数257
* J( J( E) B3 O- b  f+ A. A" l6 f34培养条件257 0 j0 s; d; n- W0 \3 }' F  g' o2 f
方案134从白血病/淋巴瘤建立连续细胞系258 # b8 E- w6 T( B" |! a, E" x0 z
35早期种系细胞的保存259 ; p' Q: K5 \, m8 Z, S- X
36细胞形态学259 * u4 \6 B8 {$ c$ g- U' h2 A5 o5 ^
方案135白血病/淋巴瘤细胞和细胞系的细胞学259 2 [" n; w: N/ L" |3 `: h2 R+ j
4细胞系的冷冻和储存260 1 X# @* Y3 C9 N6 v
41细胞的冷冻260
+ e7 n, G; b' L. P! e5 O) H方案136白血病/淋巴瘤细胞系的冷冻保存260
3 f+ ]  I1 b3 k9 _' m42储存于液相或气相261
0 g( K: Q; f% P9 V3 Q/ _5细胞系的解冻、扩增和维持261
+ e! e1 }& K( H7 j% j$ Q51细胞的解冻261 . }; m: A! i! i; a
方案137冻存白血病/淋巴瘤细胞系的解冻261 : b/ ~; T! u/ q
52细胞的扩增262
! C& _+ d2 d) y) q方案138白血病/淋巴瘤细胞系的扩增262 3 X. O0 ?, p  i6 i
53细胞系的维持263 7 j' K7 u3 B) A: h
6细胞系鉴定和公布263 ; N; `# L$ P! i+ l) R- T
61新细胞系的基本要求263 7 W4 ]" Z  y1 T, d8 u9 T7 T
62细胞系的鉴定265 , _: s9 x% t# S3 ?
63细胞系的分类267
& I% u& @! P/ C2 N( T3 q7生物安全性268
3 M: y8 ]  B& c& m8评述269
5 v1 T. g% v" h9 Y81一般情况下要考虑的因素269
1 f$ R0 a& j# |: p" O9 n82培养环境269 2 d8 q& X+ K% x& Z
83细胞培养的常见问题270 . E& j9 E. @# _4 z$ }, y
84时间上的考虑270 2 g' L% @) h0 N
材料来源271 - K8 |( D. ^2 D- I
参考文献272第14章恶性脑肿瘤的体外培养275
( b; _2 s8 r# |2 q: u  }/ k1引言275
5 L& }% H$ Y( `4 I5 |/ c4 x& M11恶性脑肿瘤的发病率、组织学和预后275
; H( ?( s. v6 c; J0 z) F12恶性脑肿瘤的细胞培养276 ' _( x# }5 B) T- D3 \/ z! [! ]
2培养基及试剂的配制278 1 g3 w) h" I- F2 p' k  k
21活检组织的采集和处理278
' ]+ H/ Z* U% x; E: R/ [* d4 |22培养基和血清278 1 U  l( D; Z6 P4 q! h& Z7 e
23酶279 ) V2 ]' r0 H+ b6 D  u2 Q6 `5 l. q
24其他试剂279 & l  u4 M' ^4 A" m& X0 n- Q
3短期培养的方法279 9 O9 v5 X8 W6 u
31胶原酶分解取材的单层细胞培养279 1 d" G' k7 D: i/ U2 |# z  M
方案141胶原酶分解与脑肿瘤的原代培养280 6 H" {$ X+ z% k1 v9 R3 A4 x& `: {2 ]
32其他分解离散方法281 9 E( Y  I1 T, o6 G( c6 @
33小的外科手术活检组织的移植培养281 + K* V4 h. y5 Y! \
方案142脑肿瘤的原代移植培养281 + T+ ?8 L0 y9 W
34其他移植物培养方法281
, d: f& V# `3 n5 a35换液、传代和污染试验282 ! {% L$ S) O* S+ N7 V
方案143源于原代培养的脑肿瘤细胞的传代282
7 P! S8 V4 |- t. P/ |方案144脑肿瘤培养物的支原体筛查284
7 C5 U0 z; E; R方案145脑肿瘤培养物的冷冻保存285
$ X2 f  @1 n4 W& x4脑肿瘤培养物抗原表型的测定285 * P. P7 z. I6 V/ _- R6 ]0 G0 _
41细胞浆抗原的染色285 4 E' Q: T+ l) `! l9 L
方案146脑肿瘤培养物的细胞浆抗原的免疫染色方法285
2 {1 f2 y, S- B9 \1 M8 Y3 g) V, ?% c42细胞核抗原的染色286
: {# U& y) g) D' {& t0 B方案147脑肿瘤培养物的细胞核抗原的免疫染色方法286 3 N( }  {& Z. ~
43细胞表面抗原的染色287
7 a, n4 L* y2 |- v+ P3 L方案148脑肿瘤培养物的细胞表面抗原的免疫染色方法287
8 v8 O8 s8 j4 e3 ~5安全提示288
! v, u: S# ]* |. m2 {: \致谢289
7 e8 B% m% s" S, F1 Q材料来源289
2 O% m' t' N! t: a) B+ b. L$ p参考文献290第15章人神经内分泌肿瘤细胞的培养293 - r* s4 A0 g0 T/ J, t
1引言293 4 x  y3 Y7 y$ F. k
2试剂和材料294
3 f$ s% T" _9 B) o9 o4 p4 X5 v# a21转运培养基294 / p* V( ~5 r: I* T# C1 q$ `: B, i
22从成纤维细胞中分离肿瘤细胞的胶原酶培养基294
" \0 j, l- C- f4 t" E$ ^/ X% L23D多聚赖氨酸包被培养容器294
$ p4 |1 d- h7 d: C! B2 s. T5 c24生长培养基295 ; a8 [7 _# n4 ~4 y
25用于细胞遗传学分析的生长培养基295
/ c+ z- R0 p* T+ V26无血清的培养基（改进Brower等人的技术）295
4 t8 c" t9 E5 ~2 Y3肿瘤标本的收集和冻存295 4 }# c4 Q" M/ R4 D4 P/ C) g) g
31肿瘤标本的收集296
# T9 u0 v+ f9 C  M方案151神经内分泌肿瘤标本的收集296 ' I$ Y( o  H+ c0 P4 D
32活检标本的冷冻296 2 `! I5 Z) _. W/ U. d: B
方案152神经内分泌肿瘤活检标本的冻存296
8 L, C- N) y6 M# K+ B9 R  Y4原代培养297 # Q. f+ ]2 S2 m; q* h9 z+ p
方案153神经内分泌肿瘤标本的原代外植块培养297
. X- C9 Z; H( ~1 }5 y0 r方案154机械分散神经内分泌肿瘤标本的原代培养298 * ^: h4 Z3 N, a
5长期培养和连续细胞系299 : g3 k( [1 h' y/ w! l5 Q8 w; d
方案155非贴壁细胞系传代培养300 6 J& S2 _2 ]; ]' `3 d
方案156去除神经内分泌培养物中的成纤维细胞300
+ H* R( S. F6 e7 Q( A6培养细胞的低温储藏300
4 k! E7 }( h  u: Y6 D# v4 o方案157培养的神经内分泌细胞的低温储藏300 7 A5 V6 M+ l& e8 c" q0 B
7特性鉴定301
% ^* a1 u; x, p2 _! `+ B71免疫细胞化学301 . k! q7 e% p0 W5 [' h6 I! y$ A6 p
方案158培养的神经内分泌细胞的免疫细胞化学301
" U! q: N- _0 e' E72电子显微镜术303
! Q( r! L* {- S0 p& ~方案159神经内分泌培养物的透射电子显微术304 3 m' s! G& R7 S9 k4 }0 g' ]+ \' m
方案1510神经内分泌培养物的扫描电子显微术305 # p. m7 A% [6 y; F7 d1 D
73细胞遗传学分析306 ) b# v% d$ L" Y& T. F
方案1511贴壁的和悬浮的神经内分泌细胞的染色体分析307
3 _) L: G7 z. |0 I1 u# e74MTC细胞系的致瘤性检测307
5 E3 b$ s0 ~# r! \方案1512神经内分泌肿瘤细胞在裸鼠体内的致瘤性307
3 y! L2 w" P7 r4 e8结果和应用308 3 c8 Y$ T9 n! p+ f2 T& d0 Q
81建立细胞系308
  l9 L5 z8 M5 Z82特性308
; a- _- y7 @+ `+ ?83抗癌药物筛选311
& W3 s* z5 h  }# `% z84凋亡311 5 N5 g. P0 K$ U9 t7 R& p
85治疗312
5 D1 @( h) @, P3 i! n9细胞库里已建立的细胞系312
! [( V: r9 c% E' R& Z, q( N; [91美国模式培养物保藏所（ATCC）312 9 Z# q' W& R- F
92欧洲细胞培养物保藏所（ECACC）312 / `  @) G* v; [5 R# U
致谢312
# ~" f) r; ]* {0 K材料来源313 & z# \- P) T/ k  y2 K
参考文献315
) [, X: z& U  L缩写词表319
/ \9 \+ ]+ d( d2 M附录供应商名录325
4 i# _8 u6 n& B4 a索引341 : q/ V/ j, K+ W  d' [  s  P2 L+ U& T

9 x3 _5 M5 n2 L) q6 S, W1 f1 o
2 d: z6 o( Y! d: S: X( W5 j( Z

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