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求助:我的CIK怎么了? [复制链接]

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楼主
发表于 2012-11-28 16:35 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
     最近养CIK连续一周了,分血后细胞计数存有大量黑色小点,反光,个人怀疑是血小板。培养几天后,有的瓶子,黑点越来越多,贴壁居多。四五天后,贴壁主要是黑点,养的CIK细胞死的很多,扩增很少。请问谁知道怎么回事啊?
* o. _' c) v, n1 g$ v% s& D  分血了8份血了,都有这个情况。是个人操作吗?  那为啥以前没有呢?还有最近发现离心机离心后,就是吸白膜层的时候,发现白膜层下的FICOLL是红色的,以前一直是白色的。是FICOLL的原因吗,最近用的是新批号的。4 L& q# F7 J- ?0 p1 F- ]
  
7 C2 ~( I$ @' L6 a3 Q  {
- a' s8 e- w0 c5 I2 Z/ V. @6 c; b% w7 B   具体描述黑点:细胞计数时,不是用台酚蓝染色吗,绝大数CIK细胞体积较大,但是其间存有少量体积小的也是很亮的细胞。当混悬细胞培养时,在奥林巴斯倒置显微镜下观察,10乘20倍像素下观察,显黑色,但是调节粗螺旋和西螺旋观看,可发现黑点也反光。   做了各项物质的内毒和革兰氏检测,无菌也做了,都没问题?: I+ s2 X" L5 l- M/ _  W5 F
   原因何在啊?. g" @% {! I& k9 C- g) Q! F% ^
; c) K* \9 O7 F; j, i* h

) q+ e* ?5 d* v, g0 ]
, Y7 u; O! P6 x0 r  h9 s7 t  元芳,此事你怎么看?  
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沙发
发表于 2012-11-28 16:40 |只看该作者
顺便提一句,11月14日 ,本人清理了一下孵化箱,用纯化水加苯扎溴铵,清洗了一下孵化箱,于是从11月15日,噩梦开始。* n1 ]$ c" n* ^% Z2 K

+ g; H$ J, N. z' Z2 h% ]0 M后来于11月22日,又重新清理了一下孵化箱,27号分血,今天28号观察还是有,可是有意思的是,一瓶多点,开始贴壁,一瓶很少。顺便说一下,先头分血的,有的丢了,有的加因子处理,扩瓶了,后来细胞长起来的,黑点越来越少;而黑点多的,现在细胞很少,瓶底成了黑色的海洋。
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藤椅
发表于 2012-11-29 09:37 |只看该作者
发图片上来看看

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板凳
发表于 2012-11-30 11:47 |只看该作者
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白膜层下面的ficoll成红色,如果每份血都成红色,应该是分离液的问题,如果个别血样成红色,应该是样本差异的问题。
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报纸
发表于 2012-11-30 15:33 |只看该作者
白膜层下的FICOLL呈红色,估计分离液有问题的可能性比较大,可以适当提高离心速度,或者铺平面的时候多分出来几管试试。
2 q' d% L4 _. Y* L+ d我想知道你的CIK做法,在单个核分离前是否进行血浆分离?分离结束后是否进行贴壁分离DC与CIK?是把单个核细胞分离后直接按照CIK的方法养的?& ^7 K. Y, L; ~0 U* e
我感觉你说的嘿嘿的东西是血小板,可以试试先进行血浆分离再做。3 t& V: T9 r$ Y! U1 [0 r2 s
我不是很确定 所以仅供参考
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地板
发表于 2012-12-7 16:58 |只看该作者
回复 kiss2346 的帖子
$ w: `7 Q7 T& s' s5 _
, ]# U8 p% y5 T: h5 |& O8 g$ r最近一直挺忙的,首先,我的CIK是分离血浆的;第二,分离后进行贴壁分离DC\CIK;第三,我们提高离心速度后,分离液又变的透明了,查看了厂家FICOLL的说明书后,大致可以推测可能是气候原因,天气冷了,GMP车间内温度最近一直在20度以下。
- c5 y( ]7 \& ?' ~8 k  p8 e! f  f- H  I( l9 d- H0 ^
再提高离心速度后,分血依然存在黑黑的东西,手机拍不了照,郁闷。不过现在离心后,少了很多。有人说是血小板,有人说是细胞碎片,有人说是粒细胞。( c/ A" h" b* k. ^/ a) c

3 N4 P/ ^0 i& P8 k   镜下观察,在4×10下观察,与透亮的细胞相比,小很多,呈黑色颗粒,观察有悬浮的,不过绝大多数贴壁。  在40×10观察下,调节粗细螺旋,可以发现,这种物质呈绿豆样,在一定角度下,也反光,透亮。6 r) X' v9 [+ {* ?/ x, `
6 R$ [# B' V" \0 x6 y. [' ?& W$ G/ z
- W- u3 F* I4 V' Z$ r/ C
元芳,你怎么看?
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发表于 2013-1-7 08:50 |只看该作者
回复 突击兵之小土豆 的帖子/ z: k$ r$ z" u
( I+ j4 I0 n# k% v
你每次做培养之前不会用计数仪进行计数么? 最近每次做的时候在正常要进行贴壁培养的时候,再添加一步1200/10min的离心,能够较好的去掉血小板,如果不放心可以再加一步。看看效果,感觉一下是什么东西在里面。还有一种可能那些东西是红细胞,不过红细胞在培养一段时间之后一般会自行裂解,不过有红细胞 和血小板的细胞在初期看的时候培养液都会非常脏,一直有各种各样的碎片在里面。这个还是要你自己去判断了,天气变冷适当调节一点条件试试吧
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发表于 2013-1-7 08:51 |只看该作者
还有最好是在培养前进行一下计数  用仪器。。。。这样可以初步判断 血小板的量 红细胞的量  还有你分离结束后 分离出来的细胞沉淀是不是红的?还是白的?如果是红的 真的很有可能是红细胞在里面 。
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发表于 2013-2-26 11:18 |只看该作者
你在培养过程中是否加了血清,有没有可能是黑胶虫
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