酶消化法养脐带间充质，求助大神们

老姜

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3 }. N2 [- h$ A
从上图看你传代的细胞汇合率太低，一般要达到汇合85——95%传代，细胞收获量大，并且增殖能力也不差。0.25%的trypsin我认为浓度太高，Trypsin对细胞的损伤力较强，可用0.05%trypsin-0.53mM的EDTA消化效果好，对细胞损伤也小。试试看！

老姜

6号照片是用缓冲液洗涤完照的相吧？若不是则是细胞太老，这种细胞没有增殖能力。4、5号照片细胞状态不错，传了代呈3、6号的话，应该是消化出了问题，前后用一批血清吗？若是，最好在细胞增殖快的时候两天换一次液，血清的质量一定要很好吆。还有接种细胞太稀，细胞在2天之内不进入增殖期，血清质量再差些细胞则长呈这样。接种(6-8)×103/cm2试试吧！

bings214

回复 老姜 的帖子8 y7 V( W( p$ |6 [* r& W4 I' j. B

, ?9 S" o7 t  P# ~- k9 Y好的，谢谢啊！我的邮箱是bings0214@yahoo.com.cn  麻烦你到时候发到这邮箱。

湖南干细胞

6 d: p: ]: ?* I0 I' \* c6 U% H) c9 D4 B; S7 X
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1 ]& Q; b1 q, r$ u# G
谢谢，6号照片是换液前没有洗拍的，前后用的是同一批血清（GIBCO，USA），我下次配用低浓度的胰酶。据你看，2.7号那些传代前的照片大约是？%的汇合率。请问有没有85——95%汇合的照片可供参考，我没有经验掌握得不好。
: F# G$ A/ v, y# r2 q) A2 L1 k6 ~传代之后现在已经是第7天了，还没有再次传代。

老姜

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1 R: N, t3 P8 z3 r1 ]) x. [5 s
9 s/ Y2 j% s$ U7 H2 k5 \汇合率指间充质细胞培养扩增后伸展开占培养器皿底面积的百分率，没法严格界定，一般汇合率低于40%以下是不提“培养细胞扩增汇合达...”，实质这种状态只是细胞伸展开，并没扩增，第4张照片属于这种状态；第5张照片汇合率也就45-50%，按你培养近一周次日传代必定达不到汇合85%以上，所以你说消化下来细胞不多就很自然。你将我所有回复捋顺就是完整的培养全过程。85-95%汇合照片还真没有，这些的“问题”不是我们平台课题组的问题......。

湖南干细胞

回复 老姜 的帖子8 \+ H6 a/ {7 ?0 ~+ ~9 C2 z" \
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谢谢指教。我会认真看看你全部的回复的。

湖南干细胞

回复 老姜 的帖子3 z  y( s8 |' Z$ G7 ]: g5 c- f  _" G0 {
7 ~) e- R+ F. O* r! D/ N. `
查了一下0.05%trypsin-0.53mM的EDTA的配制，是100ml PBS中同时加0.05g胰酶+0.02gEDTA，溶解后过虑不？要现配现用还是可以储存？

老姜

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6 p4 d. R; H) U+ }( T6 K! t
配制：1:250的Trypsin 0.1g，加PBS-A 约150ml±，4度过夜（充分溶解），次日加EDTA-Na2 39.4574mg，加PBS-A至200ml。0.22μm滤膜过滤除菌，分装（5-10ml），-20度储存，融化后d的试剂可一直储存4度直至用完。消化细胞10cm皿一次加0.8ml足矣，37度3min。消化完毕的细胞一定要离心，弃上清。然后，加完全培养液培养。

湖南干细胞

回复 老姜 的帖子5 A# ^; z  J  ~- L& |- b4 t
1 _& V3 @6 {9 T9 u! ^8 X
谢谢，没哟PBS-A的话，PBS可以用不？影响活性不？

老姜

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! ?: c. M1 d6 \: t0 _8 V  `3 G- w, A& E3 Y0 x/ V
PBS一A的意思是PBS缓冲液中不含钙离子和镁离子。Trypsin必须用无钙镁缓冲液配制。钙和镁起使细胞结合更牢固的作用。