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关于慢病毒转染白血病细胞系后G418筛选的问题? [复制链接]

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楼主
发表于 2013-1-31 14:15 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
     用携带neo基因的慢病毒转染白血病细胞系,想获得稳定表达的细胞系,理论上应该用G418筛选。但是从丁香园上看了一些帖子,发现用G418筛选悬浮细胞的时候,操作远远比理论复杂的多,经常会出现细胞全部死亡,或者细胞碎片无法除去,或者丢失的细胞太多等等情况。
! U; h8 t8 a  M0 k     于是我想问,1. 转染后,从荧光显微镜下观察GFP的表达,如果转染效率能达到95%以上,是否可以不用G418筛选?  I% k$ M5 |9 Y& L+ V
                          2. 如果不筛选,多次传代以后,稳定转染的细胞是不是会越来越少?剩下的都相当于没有转染的细胞了?, _8 F; O% g2 v9 y  O
                          谢谢!!
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沙发
发表于 2013-1-31 21:00 |只看该作者
那你也已试试有限稀释法啊,每次挑选含有荧光的培养皿,多穿几代试试
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藤椅
发表于 2013-2-1 09:31 |只看该作者
回复 goblinwang 的帖子' e. z  C  {2 G/ \! S

9 |7 X) v( `' Q0 U谢谢!因为之前没有做过,所以还想问一下,您的意思是用有限稀释法,不用加G418了对吗?
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板凳
发表于 2013-2-1 19:06 |只看该作者
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个人觉得还是要加,因为很难做到每个皿只有一个细胞的这种可能,毕竟不是贴壁细胞,但是你的G418的量可以随你细胞传的次数慢慢减少,这个说明书上有说过
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报纸
发表于 2013-2-4 10:49 |只看该作者
回复 goblinwang 的帖子
: a. Y8 h. X  J  `' u
+ q" e  A0 w. e( u5 @7 s4 B& ?- v十分感谢!

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地板
发表于 2013-3-23 18:11 |只看该作者
我觉得:
& p. ~" |, b' l' M- E1.如果有GFP,可以先用FACs筛选一遍;  C+ F# @5 J* u% s3 C  A
2.G418杀细胞很慢,但会在某一天全部死掉,因此要重新摸合适浓度,一般一周左右死掉的最低浓度,如果死太快,应该是浓度高了;
3 ^: D* @2 [6 S* z; q3.可将G418替换成puro或hygro,应该会更好筛选一些         
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