关于慢病毒转染白血病细胞系后G418筛选的问题？

zhuangyong1216

     用携带neo基因的慢病毒转染白血病细胞系，想获得稳定表达的细胞系，理论上应该用G418筛选。但是从丁香园上看了一些帖子，发现用G418筛选悬浮细胞的时候，操作远远比理论复杂的多，经常会出现细胞全部死亡，或者细胞碎片无法除去，或者丢失的细胞太多等等情况。7 H2 @, ~  U: G' @+ x( A7 I
     于是我想问，1. 转染后，从荧光显微镜下观察GFP的表达，如果转染效率能达到95%以上，是否可以不用G418筛选？5 F9 n/ e1 q2 J0 ^/ n# {$ a5 @  T
                          2. 如果不筛选，多次传代以后，稳定转染的细胞是不是会越来越少？剩下的都相当于没有转染的细胞了？
" ^7 b& P9 \& y* W7 I4 C& O0 o                          谢谢！！

goblinwang

那你也已试试有限稀释法啊，每次挑选含有荧光的培养皿，多穿几代试试

zhuangyong1216

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谢谢！因为之前没有做过，所以还想问一下，您的意思是用有限稀释法，不用加G418了对吗？

goblinwang

个人觉得还是要加，因为很难做到每个皿只有一个细胞的这种可能，毕竟不是贴壁细胞，但是你的G418的量可以随你细胞传的次数慢慢减少，这个说明书上有说过

zhuangyong1216

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十分感谢！

hynew

我觉得：% t8 B) g% C/ }: U
1.如果有GFP，可以先用FACs筛选一遍；
6 |! G5 O* d9 @# ~' t2.G418杀细胞很慢，但会在某一天全部死掉，因此要重新摸合适浓度，一般一周左右死掉的最低浓度，如果死太快，应该是浓度高了；
* I4 t+ b# q9 H: ?$ c) i2 }3.可将G418替换成puro或hygro，应该会更好筛选一些