关于PI，Hoechst33342染色的问题

a2782953

最近在做精子的死活染色实验，发现自己使用荧光显微镜观察用PI/Hoechst33342染色的精子时候出现一个问题：几乎全部的精子，》98%，都可以被这两种染料同时染上，并没有出现在其他文章中所说的，Hoechst33342染活的，PI染死的这种情况，做了多次实验，换用了不同浓度，使用了不同缓冲液（PBS，Hepes），发现这种情况没有变化。不知道有没有做过类似实验的同学，给点建议吧！另外一直有一个疑问：Hoechst33342按照说明是膜透过性染料，可以通过完整细胞膜对活的细胞和固定后的细胞染色。我想：固定后的细胞不就是死细胞么，这句话的意思不就是：Hoechst33342可以染活细胞和死细胞的意思么？

zpzp0312

其实这两个染料的机制都是和核算结合，只是33342能穿透获得细胞膜；PI不能穿透活细胞膜。
  t9 i! R# R/ A5 r8 @! Q/ y也可以认为33342既能够染死细胞，又能够染活细胞

monk125

嗯　你可以查一下３３３４２膜通透性高，可以染活细胞，更别说死细胞了，ＰＩ染料膜通透性低，只能进入死细胞中与双链ＤＮＡ结合　

南宫燚岚

细胞的活死染色从来都是用标准的live/dead staining的方法，即活细胞用Calcein-AM（钙黄绿素）死细胞用PI或其他的来表征，没有用33342的，虽说33342可以穿膜，但是常规方法包括paper里面都没有用33342来表征活细胞的。' ~- N) Y' s5 J/ k, y" d! H
建议楼主以后做这种常规性试验还是要跟已有研究相吻合，不要尝试那些理论上可行但是并不被广泛采用的方法。

lipd09@mails

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PI(碘化丙啶），我也用来染活细胞，也可以在显微镜下观察到所用的细胞都发红色荧光，死的细胞更没问题了。Hoechst33342 细胞死活都可以染上，Invitrogen有一款试剂盒为live/dead staining可以很好的区分死细胞和活细胞，你可以试试。

a2782953

回复 南宫燚岚 的帖子
5 ?. b. O5 G, V! b/ o' s8 ?$ _! q- O( O: [; f; @# p) Z
这些方法确实刚刚涉及，谢谢这位同学的建议！我也是看了一些文章中说33342是用来染活细胞的所以感觉有点想不通，比如这篇文章中开头就明确的指出了33342是用来染活细胞的。所以导致我也很糊涂了。
1 G! p/ h- E( q& {7 L6 e3 C2 S9 k 2009 Hoechst 33342 The dye that enabled differentiation of living X-and Y-chromo.pdf (641.66 KB)

2013-2-2 21:05 上传

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a2782953

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7 C0 w* T" h" i' L$ v9 D回复 lipd09@mails 的帖子
" D2 p+ f9 u9 r; ]; ~4 f: l0 r% O# I) r6 q+ g* j% y2 `, J( ^
谢谢回复！正好实验室有33342和PI，所以就试着按照有些文献中的试试了，但是结果很让我意外，跟文献上差别较大，也可能是因为他们使用的是流式细胞仪而我是用荧光显微镜来直接观察的，所以在光的灵敏度区分方面差的太多。live/dead staining 那个试剂盒好贵的。。。，而且试剂盒里面用来染死细胞的也是PI，就怕买来染了之后发现，所有细胞全显红色，那就还是得再忙活。呵呵，我想如果我能用简单的方法染出来就不用花那么多钱了。。

a2782953

5 W! V6 I2 c( e7 z
: r& ~" K+ m' j: |6 ?其实在查找了一些资料后我觉得，是不是区别就在光的强度上呢，利用流式细胞仪可以通过多次预实验，划定目标区域的细胞来筛选，这样即使PI确实可能将活细胞也染上了，但是在活细胞的着色强度低，这样通过预实验将其在后续试验中剔除就可以了，最后还是可以得到目的活细胞的。而利用荧光显微镜直接观察就不行了（也可能也得经过多次预实验，掌握好曝光度，也有可能使自己数出正确的活细胞数吧，不确定。。）所以，还是换用别的方法了，比如伊红染色，总之还是得试试。

cheetah2020

从文献上看，一般固定切片的细胞核多数用PI来染。Hoechst我所知的一个用途是用在核移植中去卵母细胞核（区）。