请教大家一个有关阻断信号通路的问题

ind6562

各位高人，我想用siRNA阻断我所培养细胞的wnt/β-catenin信号通路，有人能告诉我具体的步骤吗？- {9 d" F: O  K3 }5 ?8 v
我看的文献说是将能阻断β-catenin的siRNA先与转染液一起孵育形成转染复合物，然后将转染复合物加入到培养基中（请问大家这里是不是要用特殊的培养基，还有要不要加血清？），再用这个培养基处理细胞数个小时。请问是这样处理就行了吗，中间会不会还有其他步骤？还有一个极其重要的问题：这些过程是如何做到无菌操作的？
' l9 M4 m0 I9 N) x% z; k如果有做过类似实验的人，能告诉我一下具体的步骤吗？感激不尽！

461650833

可以构建shRNA干扰载体 直接转染啊

ind6562

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6 s3 w% N9 m! d* m
不好意思，可以讲详细些吗？

monk125

这是求步骤的吗？ 看你写这个是用lipo2000脂质体做的瞬转吧？+ h& v/ e+ e! Q& K" `
你买lipo2000的时候会送你操作步骤的，这个你放心好了，上面很具体
( j; x0 S* L# k8 G& g还有就是培养基的问题 转染所用的培养基是无血清的培养基 跟你你养该株细胞的培养基一样的 不过是无血清的 但是 实际上只是混合液是无血清的 你的细胞还是预留一部分完全培液的 , K9 Q+ j: F9 h1 V9 e( q
一般的步骤是* Y2 _' S& a- I1 D  l8 H; ]* B: T
1 转染前换新培液/ D% B3 r% ?* \- k, C# J! z
2 lipo2000与无血清培液混合静置5min 同时质粒或者siRNA与无血清培液混合静置5min
  `5 W6 I& D  z) \3 上述两种混合液一起混合 并静置20min
  t& v3 M* H3 E* Z4 N% [4 转染细胞4-6h后换新培液
3 O; x: N# f& `' `" Y# P' r7 Y: j, Q% [% N2 ^# b+ W) R
注意：做好control 对照试验 培液要先预热 细胞不要长太满，切提前一天铺板

ind6562

回复 monk125 的帖子, W. D. o( b# a7 G- y

3 L7 n3 [1 b; c  j太感谢了！！

ind6562

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: }; O4 Q" K/ F% e
! o% B6 {. H; H, b; T8 v3 L+ R5 p  y高人，不好意思，我想再请教您一个问题。好像做正式的转染实验前要做一个检测转染效率的实验（貌似是用荧光什么的来检测），但siRNA和lipo2000试剂盒里我没发现什么带荧光的东西（其实lipo2000说明书我已经看过，但里面很多内容我还不理解，惭愧~），是不是要另外买一个试剂来测转染效率呢，能麻烦您给我说明一下这是什么情况吗？

monk125

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8 E  s! r* m8 W& C" S. Q  FsiRNA 就没办法做转染效率检测了，像质粒形式的shRNA是可以做效率检测的，比如你control 组的空白质粒上有GFP荧光标记，你可以做几组不同的浓度梯度，然后流式或荧光显微镜 看你的GFP positive那群细胞的比例，在某范围内应该成线性的，你就知道大致效率了。

monk125

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! ^) M. e. a9 h2 J! z: j8 D
+ Z: j/ \- l7 T. I$ W2 zsiRNA 的效率怎么测 我也不懂 只能你设好梯度后 收细胞测靶基因mRNA浓度的变化了，做个realtime 就知道了

86964109

回复 ind6562 的帖子& h" {5 ]9 V' ^7 k/ D
( n- s1 s& ^( q
siRNA也可以加荧光标记的，另外，一般会设置一个荧光标记的阴性对照，侧面反映转染效率，siRNA干扰需要好多对照，详情参考这个帖子吧http://www.dxy.cn/bbs/thread/7151795#7151795