[求助] 小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验，用WST-1检测OD值过低，？？？？、

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最近做小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验，用Con A刺激，用碧云天的WST-1试剂盒检测，但是检测的OD值过低，也没有明显的增殖，这是怎么回事啊？
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具体操作步骤如下：* M; F; E& ?$ p' O- a! }/ G) e

" Q- z* |3 l) h# r6 f8 y- b一 小鼠淋巴细胞的获取：
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1、断颈处死小鼠，浸泡 于 75% 的乙醇中。6 |/ k/ H5 e, Q# k6 |0 C( V

) t: l- J7 c9 K9 i3 }2、在超净台中取出小鼠脾脏，将脾脏在DPBS中洗3遍，充分湿润。
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3、将200目得纱布至于35mm的皿上（不可用6cm皿），将纱布绷紧，底下盛有少量DPBS，用10ml注射器的活塞按一个方向均匀研磨研磨，边研磨边用DPBS湿润。% G. M& x% g5 J, D/ k; `+ k

8 _: z, M: O- X4. 将收集到的淋巴细胞悬液1500 rpm离心3min，每个脾脏加入7ml红细胞裂解液，室温作用30min。
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: s4 d7 @: w( v) a0 x  @- g5、1500 rpm离心3min 弃去上清，再用DPBS洗涤3遍，每次用4mlPDBS洗涤，一般在第二遍洗涤后方可见到明显的血细胞被移除，最后用1ml DPBS重悬。
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6. 用牛血清湿润试管壁，除去多余血清，取4ml的70% Percoll 加在15ml 离心管的底层: ~, r: j! |, y& k* w

" R8 b6 T, c1 ]* M! c0 n7.用巴斯德管吸取4ml 40% Percoll，试管稍倾，在距离液面1cm处紧贴管壁任其自然慢慢流下，注意勿破坏分离层的界面。
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* ]8 A) U9 T3 |9 s8 `2 r8. 将洗后的细胞悬液按步骤7中的方法缓慢将其加到分离液的表面。
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9.将离心机的加速度调为0，在水平离心机上800g（我们的为2000rpm）室温离心20min。# K/ t. Z# i2 P, |& J7 O% x
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10.吸取40% percoll和70%percoll之间的细胞，用DPBS洗涤3遍，4ml DPBS每次。; ^1 h0 U  D1 Q$ x

& Y2 O, ], b4 _0 _/ r二．细胞培养# ]5 x3 f' G: k) ^/ l' p; I3 B9 a

2 ~0 u) o" T# ~: c  e培养液：RPMI 1640,10%NCS（Gibco），双抗。' k3 }# Z" ]! }) o, ?6 ~" L3 P
三 Con A刺激小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验浓度与作用时间的摸索* Q7 B3 }. ~" G# y9 e
分别用1.25ug/ml，2.5ug/ml，5ug/ml，10ug/ml，和20ug/ml的ConA （sigma，C5275）分别刺激24h，48h 和72h，每孔10万细胞，再分别用碧云天WST-1试剂孵育4h后，检测，结果各实验组的OD值过低，基本都在0.174左右。而空白也差不多在0.17左右，都没有明显的增殖，望大家给点意见啊，不甚感激。。。
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chutu

红细胞裂解液作用30分钟，是不是时间太长了？估计对细胞影响较大。既然后面还有密度梯度离心分离，裂红的必要性不太大。另外用CFDA-SE荧光染料染色然后流式检测的方法应该比WST法灵敏。

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谢谢，还有一个问题就是，后来做了几次，已经出现了明显的增殖了，我用的阴性对照组（不加ConA组）的细胞，随着培养时间的延长，其OD值越来越低，导致我的刺激指数都快到20了，不知你们有没有遇到过这样的情况，谢谢？