电转试剂盒LONZA以及电转细胞与质粒比

wmeng

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2 G' O$ s8 i; Z6 k4 H7 ]$ F
你好，请问你用的是Amaxa NucleofectorⅡ电转仪吗，我现在在做将pEGFP-N1转染Jurkat细胞（一种悬浮细胞）的实验，电转条件是这样的：我用的是250微升的体系，其中210微升细胞（约1000万个细胞），40微升质粒（40微克），电击液直接用的是培养液RPMI1640，电转杯是BTX公司的2mm电转杯，电转之后效率很低，大概不到10%的转染率，细胞计数结果细胞大约死了80%，其实我原来也试过100微升的体系（我看了你之前的帖子里说最好是100微升的电击液），细胞100万，质粒2微克，电击液是一个师兄给的他们自己弄得另一个细胞的配方，结果几乎没什么荧光，细胞也基本都死了。我想问一下，你们有没有做jurkat电转实验，有没有什么经验可以指导一下，或者能给我一些建议吗，另外你们的电击液是买的吗，还是自己摸索的？谢谢

genedu

我用过Amaxa NucleofectorⅡ型的，你的250微升-210微升细胞（约1000万个细胞）-40微升质粒（40微克）体系，确实有点儿过，这个体系最好是200ul点击液，200万-400万细胞量，8-10ug质粒。电击液直接用培养液，电转效率肯定大打折扣。但如你若说细胞出现大量死亡的现象唯一可以解释的就是你的电转程序不对，在Amaxa NucleofectorⅡ中是没有一个固定的电转程序的，对于不同的细胞需要在几个候选的程序中就行pMAX-GFP质粒的摸索，最后才能确定最佳的电转程序。电击液是LONZA公司赚钱的主要来源，我等P民是不会摸索出来的，如果你有效价比能媲美原装电击液的东西的话，那只能说，你去开公司吧，定能赚的盆满钵满。另外我之前做过一个鸡的淋巴悬浮细胞的电转实验，电转程序用的是B013，电转效率最起码在一半以上，仅供参考

细胞海洋

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: p, D: E7 y% W3 ?8 o- g% @4 q回复 wmeng 的帖子
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看12楼

wmeng

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/ B( H/ Q$ O* J0 i1 p* ~7 K6 h7 a" K& H9 z2 `9 k/ `3 B6 G8 }- j
但我用的那个程序就叫是专门为Jurkat设计的，叫Jurkat-001（高存活率）和Jurkat-005（高表达率）。我猜转染效率低是不是因为电压太高的原因，确实正在考虑换一个程序试试，就先试一下你推荐的B013吧，谢了:)

刘金莹

回复 genedu 的帖子: [, D/ }: i; ?+ R& N
1 s( n3 D( k2 R5 `2 p
请问  您做过神经干细胞的电转吗？ lipo2000的效率在1%左右

genedu

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  q6 w, w9 Y5 A2 W; y7 n+ L3 V* n4 ~
真是对不起，真没电转过神经干，不过电转程序可以参考lonza网站

canyon

Jonathan 发表于 2014-3-13 14:27 3 f# U  I/ M, P. K2 B  Q
回复 sirius_zou 的帖子& v# T+ ~1 d+ b9 l3 r: g
# q. P' J8 F* W+ {
我用了6ug。1m的CD34+cell。完全没问题。细胞会死一些。ips出的杠杠的

) z& v7 }1 s! W
Jonathan, 你的CD34+细胞的分离一般需要多少ml血液？

缥飘实验员

回复 genedu 的帖子/ h8 q6 F3 l" Z; j( R" w9 I2 v5 j

6 e4 r3 q1 r( }* c, {前辈好，请问有没有做过 H1和 H9 的电转，现在使用 lonza NucleofectorTM 2b device 仪器，0.22的杯子，细胞100万个，100ul体系。使用 A-023程序， 现在做了GFP  2ug、7ug 的电转实验，连 GFP 都没有转进去，零星的看见几个细胞。
- Z% T/ i* T. V+ L9 T6 b; H1、转后接种到一孔六孔板上，细胞贴壁率很低不足20%，或者更严格的说只有10%，这个主要原因是细胞状态吗，还是操作有问题？对于这样需要融合度为多少合适，60%？80%，大概需要生长几天？还是电转前一天高密度接种第二天消化电转。消化我发现使用 TrypLE酶不容易吹打为单细胞，是不是 accutase 更好些？, b# s' k6 Y# W9 {  y( T0 c0 y; M5 w
2、电转液为一般的盐溶液，是这边的实验室的 protocol，具体配置不知道，转别的细胞是没有问题的。使用 bio-rad 的仪器用 PBS 作为电转液，效率也挺好的。这个是不是需要自己摸索，有钱直接买kit 是不是更好？
- C3 h" D: T8 M9 y2 l% ~# G0 z3、现在处于预实验，摸索条件做细胞梯度好还是质粒梯度更好？
6 @$ Z9 t" m& ^2 r% |4、电转实验细节上有没有特别好的建议希望分享一下，/ T& L$ Z7 u1 d2 ~* \; }/ y, s

$ D) u) p2 f2 h4 h% j3 t$ N说的有点乱，还请不介意，期待您的回复

royltc

回复 genedu 的帖子4 ^. F' B9 D5 L2 f$ a$ @. f

1 j) v5 m- e: ~  N4 _你好，我用solution T转染的cho-k1 ，转染之后培养基中就有黑黑的点状或者片状的东西，细胞死亡也差不多一半的样子，请问那些黑黑的东西是什么啊？

genedu

回复 royltc 的帖子; q# ^1 J, x. U' h: J/ M- o

) C9 ~# F  O. @: w是一些细胞碎片之类的东西，有可能你还得多摸索几个转染程序