Western Blot 的一些问题——附图

Andyhigh

最近在做一些WB 的一些试验，遇到一些问题：5 M; Y& n8 t4 e+ K# }& Q1 F
, N4 p+ `. r' X8 w$ e# q5 g
1. 图片显示的结果特异性不好，出现了三条带，如图 1
$ B) \3 j0 \  J( J2. 图片大多数出现高背景（黑色），如图 2；偶尔出现白色背景，如图 3
$ U! e+ Z( g5 }' @' J3. 有些图片结果很模糊，不能很好的确定是否含有蛋白 ，如 图 4* {" K& H2 X% R4 E' B3 P
4. 用ECL方法显色，发现 Marker转不到膜上去，不能很好的指示蛋白大小；还有发现根据氨基酸序列预测的蛋白质大小和 一抗说明书的蛋白 有差别，最大的能相差10kDa
9 q0 ~$ a" t% g/ U3 F, P+ F& v9 F* [3 `
疑问：
4 F7 }3 m! O! ^+ A" A; O1. 自己买的一抗也是2000-4000 之间的，特异性应该不错。稀释的比例也是按说明书上的最佳比例来的，那为什么特异性不好呢？2 F' K$ \( t4 q/ e# g$ h4 W' j9 S
2. 背景颜色也不知道什么原因
! w* {" M" I+ {0 `+ q; Q3. 自己上样前，没有定量。并且蛋白也没有纯化，想问下定量是必须的嘛？用什么方法呢，BSA浓度检测方便嘛？( \4 s, I/ J. x6 G" y0 H3 N
4. 大家用的是什么Marker 对蛋白进行预测标记) q2 L( u" N8 |9 V% X5 j5 ~
" D; l9 t* A! H. h) `
谢谢大家

2013-7-11 17:38 上传

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2013-7-11 17:40 上传

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Andyhigh

2013-7-11 18:00 上传

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图 4

Andyhigh

2013-7-11 18:03 上传

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图 3 白色

小渝

maker转不到膜上有可能是转膜时间短了，也有可能是转过了，还有可能你的转膜液有问题，上样前最好定量，至少保证上样量一致，出来条带比较好看，背景脏有可能是配胶的时候玻璃板没洗干净或其他原因。另外虽然抗体说明书上有推荐的比例，但是在操作还是需要自己去摸索下。个人意见而已仅供参考！

moonison

抗体出现非特异性的条带太正常了，可以试一下不同公司的抗体，如果实验室不差钱的话。

zhu1019

出现白色蛋白条带，背景黑色的情况应该是你ECL显色液加多了，或者反应时间过长；蛋白大小相差几kDa可能是由于你的蛋白有翻译后修饰。