请胞友们帮我分析一下我的WB问题出在哪里

懵懂干细胞

2013-8-4 14:54 上传

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2013-8-4 14:54 上传

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( f  u/ m; [. h4 h6 K/ s$ j: q一个内参一个PTEN蛋白检测的结果
2 j2 Y4 a, c+ @6 B: \! D  Q8 ZPTEN蛋白应该是54KD* g( f# f" N# m) w9 U3 S9 O  a
蛋白样品都是来自HuH7细胞. {8 H3 r' b( `, N! i4 t) h* s& @  p
上样量GAPDH 10微升  PTEN检测上样量为15微升
2 w# P& W8 k0 B一抗二抗洗脱都是TBST 4遍每遍9mins TBS一次 10分钟
7 \& v' X; r& y% l: D2 h. wTBST和TBS的用量都是很足够。为什么PTEN的结果还是那么难看呢？大侠帮忙看看

moluxingke

两个抗体没有可比性,内参本来就很好显,好用的内参背景一般都不会高,如果你的PTEN抗体是多抗的话,出现这种情况也很正常.你封闭如果是用BSA的话,换成脱脂牛奶.另外把一抗和二抗的多稀释一下.暴光时间不要太长.如果杂带和目的条带很近,杂带比目的条带还强很多的话,是很难显的.

dahui

降低一抗的用量，摸索一下条件，再就是目的条带的曝光略显过度，建议曝光时多选择两个时间，

20111109

1、你的背景略深，建议降低一抗浓度；: W$ u; w. U5 e( t1 p
2、建议采用压片的方法，4张压片，这样的话一般情况下第1张会特别丑，第3张的背景一般不深，且条带也很清晰的~~不会像曝光这样条带边缘不清。

meister

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: g7 D3 R, Z) I6 ?, ~( i4 [, [
& Y" Y; ]% G( J- bmarker是多大的， 那条带是 需要的？

懵懂干细胞

回复 meister 的帖子0 \* U* R: S' Z. w

3 e" ?$ m5 S4 `. K2 v2 F& W

2013-8-5 09:15 上传

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/ U  A( A2 W+ T, [$ X; m- I
这个是MArker PTEN大小应该是54KD

懵懂干细胞

回复 dahui 的帖子
% V: J' ?. I! {9 ?& e' S5 u" q7 _' Q3 d9 I1 j4 j" |
多谢！ 正准备降低一抗浓度，跑胶时间长点，再试试！

懵懂干细胞

回复 moluxingke 的帖子: B+ C! g! s! d, a6 ^' ?9 E/ ]

" U2 i' G& u: g0 h3 u) v1 B0 ~好的，接下来我将采取以下措施：换成脱脂奶粉封闭，降低一抗浓度到原先的一般，也就是1：4000，曝光时间多设几个梯度！

懵懂干细胞

回复 20111109 的帖子
$ J9 j: q# M# V
' f, U# L) s  i6 i1 r* E谢谢，不过我们这边是直接膜上显影再拍胶，不用以前的胶片方式了！
1 m. S7 P6 j' {2 I/ d9 E正准备降低一抗浓度到原先的一般，也就是1：4000，曝光时间多设几个梯度！

20111109

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! H& X2 _3 {8 u0 j8 Z
6 F6 A+ i' [7 ]8 n$ _3 m我进实验室的时候，我们这边一直用膜显影，后来boss说膜显影不如压片，因此有搞了个暗房压片，此后，一旦出现抗体不好条带不好看等等因素，boss都要求做压片，不过真心的压片出图还是不错的，显影的话是很方便，各有好处~~