求战友指点HES传代不贴壁的问题

qiushuiwuhen

各位战友，近期有3-4次传代feeder-free的HES出现相同的问题：ES完全不贴壁，使用过dispase酶还有IV胶原酶（1mg/ml）都出现相似的情况，metrigel是BD的，并且之前也使用过，没有这种问题，培养基什么的也没有大问题，实在找不出原因，每次细胞都漂浮着，看着半死不活的，请大家指点迷津，不胜感激！

bio-bin

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6 A! K, T% P: w3 |有拍下图片吗？如果metrigel真没问题，很可能是消化时间没控制好。

qiushuiwuhen

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稍等，随后上传图片，IV胶原酶消化的很慢，我做的两次大概都在1.5h左右了，dispase大概是30-40min,之后也用培养基清洗了，才种上去的，你有没有碰到这种问题，怎么解决，谢谢不吝赐教

bio-bin

消化时间太久了吧，我们用IV胶原酶(1mg/ml)消化大概是20-30min，用dispase(2mg/ml)5-10min；具体是什么问题还不好下结论，建议下次传代时的培养液加入Y27632尝试一下。

qiushuiwuhen

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) I, `6 n/ e6 ?1 M5 H, m
我在中间都会打开培养箱看看的，但是细胞根本就没有飘起来，如果强制吹打肯定会大量损伤细胞的，另外你说的时间是feederfree情况下传代消化的时间？还是有feeder的情况下的？

qiushuiwuhen

照片，请教战友

bubble_w

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9 A7 y% p1 ~* H/ `- }5 R$ Pdispase酶要求消化4-7分钟，最长不要超过10分钟，否则hES不爱贴壁。操作步骤是消化到集落的边缘稍微卷起就弃掉dispase酶，然后用DMEM/F12轻柔的冲洗3-4次，然后吸培养基2ml加入培养皿内，之后用枪头吹打下来，吹打过程中枪头可以同时在皿底将集落划成小块，然后吸起培养液中的细胞团块直接接种到新的培养皿中。如果有什么问题欢迎再交流。

qiushuiwuhen

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1 z) v) _/ F* N2 G- i: Z我是养在六孔板中的，传代的时候大概每空张到70-80%，克隆的大小约有比绿豆大小，有的时候回长的连在一起，我之前试过仅仅边缘卷边就终止消化，但是也就边的会吹掉，中间的简直坚不可摧，如果要是那枪头轻刮的话，对克隆损害超大，所以我一般是等待全部飘起再进行处理，以前就是这么干的，但是最近两三次就不行了，又重新配了培养基，情况相对好些，不知道不FGF的浓度会不会对它造成影响，之前的浓度要高些，100ng/ml，希望长的快些，最近换成10ng/ml，这个会有影响吗？

bubble_w

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( T! i0 S* o4 Z5 G" V$ D5 a" O' P" L
bFGF换了浓度细胞需要一周的时间适应。其实用吸头挂细胞木有问题的，是推荐的机械传代的一种。酶消化的时候一定不能够等到完全消化下来，当克隆漂在液体里面的时候，就是过度消化，细胞就不爱贴壁了。

qiushuiwuhen

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5 K. j2 S+ N5 V6 c) S: U1 q
$ ]3 z, l# A* e  t! i0 Q- i昨天与一个师兄探讨了下，我觉得可能跟我的消化时间还有处理方式有关系，我一般是消化30min,等待完全漂浮起来之后再去直接中和，昨天探讨完之后我又看下dispase说明书，结果就是下次消化的时候可以缩短消化时间，30变为10min，之后吸取酶，放进培养箱中在放置5min左右，再中和，再吹打带刮除，另外，你觉得培养基的PH值会不会对细胞的生长构成影响呢，我测的我的培养基PH7.5-7.6只见了都，新鲜配的7.35-7.48之间
5 n3 |8 R0 `3 b9 R+ dDispase' L0 e  x2 V( r+ I
Description
: B; m4 f. a8 M2 m) CDispase, or neutral protease, is a metalloenzyme produced by Bacillus polymyxa which has been classified as an amino-endopeptidase. This enzyme has proven to be a rapid and gentle agent for the harvest and transfer of normal diploid cells and cell lines. In addition, Dispase has been shown to effectively separate cell clumps, as well as cells from intact tissue without significantly affecting cell membrane integrity or viability.
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$ @; {+ e! k, USubculture Cells
5 p  n$ n9 p* L; E& }% u1. Aspirate culture medium and cover the cells with Dispase solution, pre-warmed to 37°C. Incubate for 5 minutes at 37°C.5 W; c& d% q$ D8 N7 W' `  f
2. Decant the Dispase solution and incubate the cells for an additional 10 minutes at 37°C.
- q) Q, i9 Q& g4 i3. Monitor cell detachment using an inverted microscope. If necessary, incubate for an additional 15 minutes or until detachment is complete.
/ d0 T& _" b0 f1 G3 q5 E' E$ m6 V4. Suspend the cells in culture medium and pellet by centrifugation.
$ e- E0 A/ E) G' \6 A- u" G5. Resuspend the cells in fresh culture medium.
+ V$ f  k, y1 J4 n$ f1 G' G/ K$ R2 I, p6. Plate the cells as usual.
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