小鼠睾丸冰冻切片（方法探讨）

20111109

我们实验室冰冻切片的通常步骤是新鲜组织直接加OCT包埋，切片，然后风干，4%PFA固定切片。, l( w- [2 d# \( K* O5 W

, U% o. l: Q4 e  L- e1 R但是，由于最近做的这个抗体一直做不出荧光信号，（这个抗体是在文章里选出来的，他们在睾丸里面做出了荧光信号来）
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我又发现文章里冰冻切片的方法是：先用4%PFA固定2h，然后用OCT包埋切片的。5 m% p0 d  a& x9 W

* u, N6 e; a0 a/ E: u( W9 H我先问的是：这个先固定再切片的方法中间需要用蔗糖来梯度脱水么？如果有人做过，可否来分享交流一下子呢？
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万分感谢呢。

w343989328

先包埋切片，不用脱水，直接固定即可。

aminhair

你是哪个大学的啊?

20111109

回复 w343989328 的帖子" V& D/ w8 U9 I& J

7 F/ S2 O- p( C. T你说的就是我们实验室的常规方法哎。。。。我想知道先固定再脱水的方法呢。。。

20111109

回复 aminhair 的帖子9 w0 N" l# m# {9 _, _2 k5 b! i7 }

+ ?# u3 u; K+ \  M. p$ Gnanjing medical

lyj-0017

回复 20111109 的帖子
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我们以前是取新鲜睾丸先泡福尔马林固定过夜，进行切片前，通过梯度浓度的蔗糖液脱水，然后使用OCT包埋，切片，风干。但是，这样切出来的片子做荧光，不知道会不会受到背景荧光的影响，比如脂褐素发出的背景荧光

moluxingke

我之前做冰冻切片也是这个步骤，新鲜睾丸浸在OCT中，液氮冷冻，然后切片，切片干燥后固定，对于固定剂，我一般选用冷丙酮，PFA固定的组织有时候可能会有自发荧光。5 n- C$ k8 w9 O
根据你的方法，如果取材迅速及时，应该没有什么大问题，只是想知道你用的是什么抗体，有没有试过阳性组织。这种情况很常见，毕竟你们用的抗体和文章中介绍的抗体即使来自同一个公司，但也不一定就是同一批的，不同批次的抗体之间效果都可能会有差异的，建议你在确定抗体有效的情况下，摸索一下抗体孵育条件，比如一抗稀释浓度，抗体孵育温度以及孵育时间。祝好运！

490096812

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我们实验室的，给你看考一下+ i& w3 A  f$ U- D. X5 S  p; j
固定 将组织置于4%多聚甲醛固定液中，4℃摇床过夜。 漂洗 将固定后的标本用1X PBS漂洗三次，每次15分钟。 脱水 将组织置于30%蔗糖溶液中，4℃摇床过夜。第二天观察是否脱水完全，判断的标准是，当管竖直时，组织是否沉到蔗糖溶液的底部，若组织已完全沉降到蔗糖溶液的底部，平放或震荡后仍能沉降，则可判断组织已脱水完全。 : \& b; Q4 c7 M9 f: M6 V2 r
包埋 将组织倒入培养皿中，用眼科刀将脑和脊髓根据切片切面的需要在不同的部位切开，并做好头尾端的标记。之后将组织置于包埋盒中，用滤纸吸干组织周围多余的蔗糖溶液，滴加OCT（optimal cutting temperature compound）到包埋盒中，用移液枪头小心的将组织周围的O.C.T混匀，切忌起气泡，静止10分钟，以防切片时脱片。重新取一个包埋盒，将组织移入到包埋盒中，倒入OCT，再次用移液枪头将组织与O.C.T混匀，将组织按切片需要方向摆放于包埋盒的底部，迅速置于干冰与酒精的混合物中。在包埋盒上做好标记，用保鲜膜和锡纸包好后放入-80℃冰箱贮藏待切。

houbara

不出信号的原因很多应该系统考虑.
( N( }, F, m; C. ^以上面的处理程序,抗原完全失活可能性不大.& ?5 }5 h1 n" f" n, ^
关键是对照组要设置好,否则因素太多,很难排除.