有关精原干细胞培养的小问题

jilele

某不才，刚刚接手GS细胞（雄性小鼠）的培养，很多细节不甚明了，特发帖求助，望各位坛友不吝赐教，一起讨论。. S) t  r) V5 U6 P! L- u4 v
1）GS Medium 昂贵，但GS细胞增殖缓慢，克隆形态在六天内增长明显，但计数后发现其实细胞总数只增长了1/4，这个速度是否正常; P+ l) b& S& _, [* Q
2）文献特别指出GS细胞需要较低的饲养层密度（笔者用的是MEF，ICR品系），但实际操作上看GS细胞在低密度Feeder上增值缓慢，而且培养孔局部出现密集的圆形颗粒，具有折光性，疑为凋亡的GS细胞。GS细胞对饲养层密度以及状态要求是否严苛？4 U" |8 {* }6 L& `
3）Feeder大批量用丝裂霉素C处理后能否冻存，备用，这个问题我查了很久，有支持也有反对的，反对意见主要来自师兄师姐，因为实践发现复苏后Feeder能损失一半，且状态不好，所以坚持随用随处理新MEF
! l9 S! @: D# |. L& b% s4）用0.05% Trypsine-EDTA处理共培养物1Min就发现Feeder连带克隆整体漂起，呈白膜状，吹打后仍有丝状体，无法吹散也离不下来，但内含大量细胞，因为Feeder在铺板前用Gelatine包被培养板，且培养液为无血清体系，怀疑饲养层状态差。- o, k. ^. v1 t$ a$ r. {4 G
以上问题因初学SSC培养，所以不甚了解，欢迎大家指教

gemstone

1. 速度是正常的。
# r0 r( F  s; V: x$ J0 ^/ n5 t1 t2. 如果圆形克隆在增值，应该不是调往细胞。可以通过半乳糖苷酶染色鉴定是否是凋亡细胞。
! ?# j9 R0 U, d7 f. l% E3. 处理后的MEF可以冻存。最好是液氮冻存。计算好密度，解冻的时候会有部分细胞死亡。9 E/ V* n" ^, ]4 b' L  H
4. 理论上消化时间要长一点，刚刚漂起就中和消化，对于分散ssc并不是好事情。尝试3-5分钟后吹打，中和。

jilele

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; v3 R5 \0 R2 G& C6 @8 M5 R9 O
感谢版主，受益匪浅
& {. d$ d/ _" q. w; x% a7 V关于第二条，我指的圆形折光颗粒比正常GS细胞还要小上一半，后续培养没有见它增殖或变大，而且与基底贴附略紧，PBS都洗不下来，索性就直接跟GS克隆一起冻存了
1 P9 V. h% S8 H- C) ]& w8 a第三条，我解冻复苏的Feeder活细胞数目随冻存时间的延长越来越少了，起初160w细胞铺一个12-well板，现在240W都铺不满了，以后决定还是 现做现用
& @7 @4 D% K+ ^" f% T1 g/ x7 C第四条版主说的很对，因为GS克隆很好消化，1Min左右就分散开了，克隆就飘飘忽忽的，脱离了Feeder,但MEF还未彻底消化，如果此时中和，就会出现丝状卷曲物。我以前都是消化2min就中和了的。
: X8 P1 }" z* b9 ^# G
* z* C2 {% G! o, G4 }& K3 e: l不知版主有没有染过建系的GS细胞的CD90（Thy）抗体，我用的直标抗体（FITC），结果是阴性的，有点诧异··
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sunny218

看了楼上的同仁们应该都是 很有经验的啊！！我才开始做SSC，现在想问问大家是用什么方法分离纯化的，还有用的是什么培养基呢？需要添加那些东西呢？跪求详细的步骤啊！！

gemstone

其实Thy1阳性细胞在刚开始的几代培养中是可以检测的。如果建系以后就很难检测到了。我有同感。
% [5 c+ \- x2 f, V" ]: s5 v/ JMEF每次都坐会比较麻烦，可以一次处理，冷冻以后使用，方便。
, G1 P; R+ k8 ]
7 }, |; I3 Q- h" ?+ Qto sunny，有很多文章报道，最主要的是GDNF，bFGF，EGF， SCF等细胞因子。第一个非常重要。

细胞海洋

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看4楼