SD大鼠骨髓间充质干细胞分离培养

lyxzjr

我刚接触动物细胞培养，开始提取SD大鼠骨髓间充质干细胞，用全骨髓贴壁法，但提取了4次都没有成功，不知道是什么原因，杂细胞总是很多，细胞都没有出现大家所说的鱼群状。所以我就试了试密度梯度离心法，买了sigma percoll液，结果中间都不见白色细胞？不知道是不是我淋巴液稀释错了?现在感觉特奔溃，因为听说提取这个细胞是非常容易的，在我们实验室之前有个人第一次用密度梯度离心法分离细胞就成功了，而我做了四次都没成功，老板肯定很失望了。我的实验步骤是：9 c" {3 f/ `! Z3 {3 e, A
将大鼠断颈处死，75%酒精浸泡25min，小心分离皮肤及皮下组织，剔除股骨周围肌肉、肌腱、组织等，避免损伤血管。将股骨浸泡在添加双抗的无血清D/F培养基的玻璃皿中，至将股骨表面的肌肉、软骨全部剔除，然后将股骨移至分装有添加双抗的基础培养基的玻璃皿中，剪断股骨，用高糖DMEM/F12(1:1)基础培养基（无血清）小心反复冲洗骨髓腔至变白，收集骨髓混液，1000r/min离心4 min，弃上清液，加入体积分数为10%胎牛血清高糖DMEM/F12培养基制成细胞悬液，分装4个25cm2方瓶，置于37℃，体积分数为5%CO2的培养箱内培养。5 P* V5 ^2 v* R- b; `+ [
倒置相差显微镜下动态观察细胞形态学变化。24h后全部更换培养基，去除未贴壁细胞，以后每3d换液1次。待细胞长满至瓶底80%-90%时，用0.25%胰蛋白酶消3min，在显微镜下观察发现细胞质回缩、细胞间隙增大后加入胎牛血清五六滴终止消化，轻柔吹打全部瓶3min，避免产生气泡，将细胞悬液移入带盖的无菌刻度离心管中,1000 r/min离4min，按1∶2比例传代。
) U+ W* I9 ]3 M' x下面上我觉得细胞长的比较好的图片，大家帮我分析下，我细胞分离不出来的原因？谢谢
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sarah19860420

感觉像消化过度了，细胞在P1代就老了。第一步的酒精浸泡25min时间是不是太长了。

lyxzjr

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# V4 t9 [2 Z2 X$ K) s8 o% G* [4 V; C1 I7 m. c5 B
我有个同学取兔子的BMSCs都浸泡半小时以上，觉得影响不大。它们以前也是浸泡几分钟，发现容易染菌，时间延长后就没有染过了。我用胰酶消化时间是3min，细胞确实有点过了/ h9 \  l+ T  G3 v! q
           
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clavichord

高塘？？？？时间久了吧 我也刚开始弄

yiyi8909

文献上大多说的是用低糖，但我们实验室没有低糖的，用的高糖，好像还可以，估计传代次数多了会不好，另外，第一次换液可以半量换液，减少对细胞刺激。一直老鼠分四瓶细胞有点不足，我们一般铺三瓶比较好，新手可以先铺两瓶，增大细胞密度，这样试试。

yiyi8909

, q" J0 t  m1 ~7 p& ~这是我分的原代5天的

zhen022

酒精浸泡那步时间过长，对细胞状态影响很严重，因此需要缩短，觉得5min以下其实就可以了。因为酒精浸泡就是为了防止污染，这种情况下，其实你技术练的越好，细胞在完全接触到培养基前的时间越少越好。5 W) V: {6 ]  C# i3 y
9 X, @. Q; C& N& o& f
如果容易污染，多优化整个过程的操作方式，反正酒精这步时间太长了。器械高压消毒就可以，然后再剥离大鼠皮时候用一套剪刀，肉里面用一套剪刀，剪骨头再用最后一套。
$ h* Z7 q- v( L8 f0 H! O还有，那个冲洗后再离心也没必要，你离心是为了除掉什么？直接接种上去，8h换液一次，拿整个瓶子晃动除去漂浮细胞，直到漂浮细胞都没有（估计换了3-4次），再静置生长，两三天换液一次。后面就传代了

clavichord

我第一次就在培养皿里弄了40ml培养基加血清  放了一个礼拜 第五天半液换，不知道这样可以不  看见有细胞爬了 不知道是不是msc

sarah19860420

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. G; T% B- w& `1 r
8 ~9 j5 z& i: C不需要那么多培养基吧。都变成无氧环境了啊

lyxzjr

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, c8 y$ }! M" Y0 n- _
: a+ G3 p* A: ^$ h" h" a/ d你换液时怎么换液的呢？在这跟一个MSC分离高手求教了下，感觉主要问题出在换液和消化传代上。我以前换液都先用PBS洗一遍在换液，细胞长的不错，但传代后不好，可能是消化问题。后面我以为BMSC细胞贴的比较牢固，之后用PBS洗两遍再传代，结果每次换液都有很多细胞去掉了，我以为这是好事，去掉的是杂细胞，结果培养到后面细胞很少，也极少见梭形细胞。