求hES的复苏、冻存和传代方法（详解）

mecol

我是新手，准备养H9，最近也在学这方面的技术，在这里还请各位专家分享一下养H9的经验，最好详细一些，谢谢！

细胞海洋

寻关于th9细胞的早期文献
$ w$ G- p# f1 q, {) i+ K# Q  yhttp://www.stemcell8.cn/thread-17340-1-1.html
0 P8 V: W% s  z. \: ]# e, [

mecol

回复 细胞海洋 的帖子2 o8 F" j. e: w

. m1 W2 i( X* j3 X这个完全不相关吧，我要的是人胚胎干细胞（H9 line），不过谢谢啊

shaozi402

看过一些文献，H9和H1的培养、冻存及分化等方面很相似的

mecol

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5 _  K* C5 F3 N+ b6 G+ d
- e6 v; d6 e8 n* x2 @+ a求详解啊，我还在学习中，谢谢

shaozi402

回复 mecol 的帖子" W- j3 d3 t; d! D, Y! I$ M

" R2 a4 j8 Z) V' K这里是H1的培养方法，恢复帖子不知道怎么上传文件，这是题目：Production and transplantation of retinal cells from human and mouse embryonic stem cells

细胞海洋

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6 Y2 l$ T, d8 [; V4 t- W4 U3 i2 C2 J+ v% m, z) [+ a9 ~
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青云之上

# R% ?2 t+ D+ ~: ~: F; G/ F% P

mecol

回复 shaozi402 的帖子! t; |/ C- F! \: A5 X) g

, X3 x( t) B5 L/ k谢谢啊

MZzhang

hESCs解冻
# o' K- ]+ f- b" J( T; f; H从4℃拿出解冻细胞用的培养液，5mL加入到10mL离心管中。
" F( ^! d5 }1 x, R' e4 n- F在Matrigel培养板做好标记。
( E6 }9 |* m9 E5 |7 P' }9 F从液氮罐中拿出需要解冻的细胞，拧紧冻存管盖。将冻存管放入37℃水浴锅中，待冻存管中冰块完全溶解。擦干管壁、管盖上的水。冻存管拿入工作台中。
8 o; \. `& W/ ?9 `4 T$ p吸去Matrigel培养板中上清，加入hESCs培养液。(12孔板预先加入500μL)
$ V$ @# I/ R2 u+ F用剪口枪头将冻存管中的细胞，移入10mL离心管中，轻轻吹打、混匀。
; ?6 ]& V; o( Y+ M  q$ s1000rpm离心5min。- t- m: J& a" M
离心后，稍稍倾斜10mL离心管，用剪口黄枪头贴管壁，吸去上清。
! Y9 S, @- c% V2 Q3 n向10mL离心管中加入1mL hESCs培养液(剪口枪头)，轻轻重悬，1mL分装2孔(每孔500μL)，最终每孔1mL培养液。; b& g; C, J( v, H6 _6 O3 a* n
镜下观察，摇晃培养板，混匀细胞。' D! @* G/ q* M# B9 g
37℃培养。
+ `' f/ Y6 \; A3 A  \: u) u7 xhESCs 6-10h贴壁。
3 I: w% B' c. C/ o/ W0 |- r; q5 y1 Y, C, }0 d- {) @
hESCs冻存
( I, D& _! ]; Z: V: r5 ^hESCs吸去mTeSR培养液，加入dispase消化5-7min(一般hESCs传代为5min)；* l$ I2 B% E3 ^
消化后吸去dispase，用DM/F12洗2-3次；  g2 S5 h: a5 y/ R8 C$ c
再加入DM/F12，用剪口枪头刮细胞(朝一个方向，枪头内有培养液，边刮边打出培养液，以防细胞干燥)，重复1-2次(尽量完全收集细胞)；
& s) ^$ t$ Y8 t/ `# C* l5 w* r1000rpm离心5min，弃上清。2 w* o: n5 K. `' b6 W0 ~4 G& k( G
加入FMox重悬细胞(12孔板每孔500μL FMox，每支冻存管加500μLFMox )。
  @5 H. ?/ n; C* e( a& t6 \: J冻存管： 细胞类型、代次
' h1 J9 P6 N1 ?) m3 w+ {6 T         培养基2 l# q# V- K3 M; d
         转入或干扰基因
- ^5 E0 v, a1 |         冻存时间、冻存人
3 I8 i  {2 L) [: H9 G+ j. N( C% V; t, }( ]
hESCs传代8 C* b/ \# a) V; ^. s5 ~
1.dispase 克隆传代! T, o6 Z; a8 P! k* N2 F
剪口枪头吸去培养液，加入dispase酶，消化5-7min(消化5min后观察，克隆边缘出现卷起，小黑圈)，加入DM/F12培养液洗3次(对角线两点轻轻吹洗细胞)，加入mTeSR medium，剪口枪头朝一个方向刮细胞，1传3-4细胞。
( o  T8 t8 @5 V2.accutase 单细胞传代) I/ Z3 V/ P: B  t
剪口枪头吸去培养液，再加入accutase酶，消化1-2min(消化1min观察，克隆中细胞变亮，悬起)，将上述悬液加入有5mL DM/F12的离心管，1000rpm离心5min，离心后弃上清，加入Y27632(1:1000) mTeSR medium重悬。细胞计数，接种细胞5000 cells/孔(6孔板)。
; _" T' O; f* ^2 O7 d