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hESCs解冻
0 [. z4 @6 l( Q! `& e9 L0 u从4℃拿出解冻细胞用的培养液，5mL加入到10mL离心管中。
% X- E! \0 `( q0 O1 |在Matrigel培养板做好标记。
& G) V2 H+ c3 g从液氮罐中拿出需要解冻的细胞，拧紧冻存管盖。将冻存管放入37℃水浴锅中，待冻存管中冰块完全溶解。擦干管壁、管盖上的水。冻存管拿入工作台中。
. C7 w' f9 R+ v4 X8 \吸去Matrigel培养板中上清，加入hESCs培养液。(12孔板预先加入500μL)% b _- Y5 v6 @ g- Q" D2 @
用剪口枪头将冻存管中的细胞，移入10mL离心管中，轻轻吹打、混匀。' U# P* ]9 l# ?
1000rpm离心5min。! q4 m7 M4 |3 v7 x3 U- V) s! a z
离心后，稍稍倾斜10mL离心管，用剪口黄枪头贴管壁，吸去上清。
7 s* v! G: y0 I, O向10mL离心管中加入1mL hESCs培养液(剪口枪头)，轻轻重悬，1mL分装2孔(每孔500μL)，最终每孔1mL培养液。* \+ a5 T7 s& _% }- n6 y3 r
镜下观察，摇晃培养板，混匀细胞。5 H; s* Q6 b1 }: C$ Z
37℃培养。
1 v1 {! U" f- d% l/ w5 ShESCs 6-10h贴壁。
( y: g' R' ]4 P6 y$ U# V
K0 Q9 Y/ K$ I! Y! v7 ]4 P: ChESCs冻存# u! K: C4 w( X- |$ c; a( `
hESCs吸去mTeSR培养液，加入dispase消化5-7min(一般hESCs传代为5min)；
. ]5 S/ s) D! b+ W6 c9 X) Q! m消化后吸去dispase，用DM/F12洗2-3次；
* Y# A& ^3 q& q再加入DM/F12，用剪口枪头刮细胞(朝一个方向，枪头内有培养液，边刮边打出培养液，以防细胞干燥)，重复1-2次(尽量完全收集细胞)；
9 m( u3 s: c, W7 O+ A( l1000rpm离心5min，弃上清。
! g: @) |/ R; M7 {加入FMox重悬细胞(12孔板每孔500μL FMox，每支冻存管加500μLFMox )。" r5 f8 e# B7 A
冻存管： 细胞类型、代次* Z7 @' q+ d# x o8 e
培养基7 H% Z: H5 i) K
转入或干扰基因
/ V9 S: C+ ^2 r7 z% | 冻存时间、冻存人; C3 @! A' `; ~! t6 T: n: Q) k
! l/ A0 l7 C+ U! BhESCs传代6 V- g( b: N+ e2 N8 q3 q9 i
1.dispase 克隆传代
+ j' h2 ^5 e* L* Z剪口枪头吸去培养液，加入dispase酶，消化5-7min(消化5min后观察，克隆边缘出现卷起，小黑圈)，加入DM/F12培养液洗3次(对角线两点轻轻吹洗细胞)，加入mTeSR medium，剪口枪头朝一个方向刮细胞，1传3-4细胞。/ |+ u! U; U/ W* }
2.accutase 单细胞传代6 x4 F7 o7 D0 E% |( o! l, v8 e
剪口枪头吸去培养液，再加入accutase酶，消化1-2min(消化1min观察，克隆中细胞变亮，悬起)，将上述悬液加入有5mL DM/F12的离心管，1000rpm离心5min，离心后弃上清，加入Y27632(1:1000) mTeSR medium重悬。细胞计数，接种细胞5000 cells/孔(6孔板)。
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发表于 2014-5-5 22:12
发表于 2014-5-6 10:19
