关于western blot

仰天

最近在做WB，目的蛋白是膜蛋白，第一次做加的样本蛋白量是20μg左右，β-actin条带很好，可是没做出目的蛋白的条带，是因为蛋白量不够吗？

wangshan

对于western blot，蛋白量20ug已经足够了，我们经常上样量都不到10ug。如果没有条带，最好寻找一下其他原因，比如：western某些步骤出现问题？抗体的原因？等等。不过上样量也和你的目的蛋白表达丰度有关。对于膜蛋白提取，你是用的膜蛋白提取kit吗？

仰天

回复 wangshan 的帖子  a7 j0 l8 r0 X/ o0 K+ Y0 Z2 Z% R

- H/ D3 B9 k: h我要的目的蛋白查文献说是在膜上和细胞质里，用的是全蛋白提取试剂盒，凯基的。现在考虑可能是蛋白在我用的细胞系里表达不高，抗体用的国外的，问题应该不大。

cyz3057

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+ l- q0 g' S5 r7 D4 y6 ]( H+ q) M5 ?5 G
在做western之前 可以测定一下蛋白的浓度 我刚提了蛋白 也准备着手进行western的实验 到时可以交流一下

仰天

回复 cyz3057 的帖子: s5 u9 t* T$ s9 E/ O
7 q$ d0 d2 {+ |0 V  s# Y
蛋白浓度都是要测的，因为加样的时候要计算蛋白量尽量使不同孔的蛋白量差不多，出来的结果也方便分析。

zhu1019

1.可能你的目的蛋白表达量比较低，可以增大上样量；
, \4 i$ L; p- A* Z. o* ~2.如果你最终曝光后背景是白色的，我建议可以增加曝光时间，如果背景一片黑还没有出现目的条带，那就是没有了。