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最近,在利用TetOn 的慢病毒系统诱导猪的iPSCs,有一些疑惑想跟大家交流下!
3 u& k, Y5 w9 }: U# U! @4 ^& w+ P7 n
1. 载体基本元件的顺序为
0 Z F& j: o! X+ j( ]( G2 x含目的基因(OSKM)载体:Lenti-EF1α-EGFP-TRE-oct4,含rTTA的载体:Lenti-EF1α-rttA-IRES-EGFP; r6 O: Z/ ]. u0 V: [0 t: y0 V; N% o
在用293T细胞系进行病毒包装时,用的各种物质的量和步骤都一样,结果发现含目的基因载体的病毒滴度明显优于含rTTA的载体的病毒滴度,想知道有哪些因素可能导致这一问题?同时在病毒包装过程中,发现有一批质粒出现了污染,重新进行无菌处理,发现细胞还是出现污染(在高倍镜下出现蠕动的小虫,有点恶心哈),想问下这又是哪出了问题(基本排除操作引起的污染)。0 X! ~ b: V$ B$ V+ x& X
7 `+ t, V C {& x/ M$ D1 n9 h# [- @* o2. 在进行AP染色的时候发现一种现象:
0 S4 R- A. x* k+ t2 c9 |9 s5 u% m( V 对形成的克隆进行AP染色时,发现没形成明显克隆或已开始分化克隆的边缘呈现AP 阳性,而正常的克隆确呈现AP 阴性,想问下这是否有可能是由于克隆细胞密度较大,不易着色导致的嘛?后面将补充图片···
+ ~ b- s1 @& g- O 还有一个问题就是,是否有一种可能AP 阴性的克隆随着培养和传代,慢慢的变成了AP阳性的克隆?
. B1 S3 h: Z7 V4 k3 u, s
2 W0 A. t: ~0 `) [3. 挑取克隆时间等问题
. E/ X' o* y4 C+ |9 l 不知道大家是根据什么确定挑取克隆的时间的;前段时间挑取一个不规则的克隆(不呈现标准的圆形或椭圆形,体积适中)消化成单细胞至lif-2i体系和基础培养基体系中,发现前者第二天大量死亡,而后者3d时也没有形成克隆;而差不多大小的圆形克隆能支持单细胞传代; " Y6 h1 n( i7 n& @7 {
* `" S) a" H; |/ S
4. 克隆问题
, m, Y" W/ J$ X6 R8 T$ k 目前,自己获得的克隆进行单细胞传代后大概2-3d能形成克隆样(此时像小鼠iPSCs样克隆),但随着时间的推移,发现慢慢地向人iPSCs的形态发生转变;并且大部分克隆不发绿色荧光(7孔中6孔不发荧光,荧光为EGFP见载体,这能否说明外源性的OSKM已不表达,而内源性的调控网络可能激活?而最后一孔出现了一种奇怪的现象:出现了两种形态和颜色明显不一样的克隆A(跟其他6孔一样)和B(相较于A明显小一圈,且是在克隆A出现后3d左右大量出现的),其中A不发绿色荧光,而B发荧光(很强),后面将附图说明。有人帮忙推断,这有可能是细胞不纯 或 细胞癌变 导致的。并且这些克隆基本上(出现了如上AP染色问题,所以用了基本)呈现AP 阴性,但A克隆能支持单细胞传代,B克隆正在试验。
, O# v. s) X6 g4 l 由于使用的是DOX系统,根据个人的认识,好像猪iPSCs 上这样的克隆都需外源添加 DOX等维持外源OSKM的表达,而维持克隆的未分化状态。在小鼠上,好像看到个一篇用TetOn系统诱导的克隆,在撤除Dox后,细胞还能维持未分化状态,说明其内源性的多能性调控网络已激活,但这篇文章找不到了,不知道有没有高手提供点线索。在猪上自己还没有见到过这样的文章,不知道有没有可能存在这种情况。目前,试验缺少重复,还需完善;并且图片还没拷贝出来,后面将附图,希望大家根据自己的知识解答下我的疑惑。! p; a4 f& x- g' H; |4 n: V/ J$ R9 g
' `) ]! W9 L3 N0 P0 K补充内容 (2014-10-5 19:35):
; T, m1 l: t# w& {) \( {( D今天发现 B 类克隆保持了之前克隆的形态和颜色,而A 类克隆是在 B 类 克隆进行单细胞传代后形成的克隆,目前该克隆的增殖能力还在检测当中(之前的判断有误或存在偏差,没有直接证据证明该克隆能支持单细胞传代) |
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