石蜡切片之HE染色与免疫荧光

yeshch

本人近来石蜡切片一直做不好，出现以下问题不知为何或者没有找到解决方案，还望有经验的家友多多指点。问题如下：- I7 m* ^: q, o; L
1、材料由4%PFA固定，包埋之前自从脱水开始便皱缩，一直持续到浸蜡完成也未得到缓解。. t3 m' m; a$ S$ \1 b( {
2、HE染完色之后用清水冲洗时很容易褪色，基本染不上，不知为何，怎样调整染色时间和水洗时间都染不好；
, y' M( W+ \. Y; O9 n. ^7 y0 g3、材料在操作过程中很容易脱离载玻片，使得材料表面不平整，容易残留液体。2 s' F% Q( |7 R/ W: U! z% A
4、免疫荧光封闭液用5%BSA取代影响大吗？一抗染的时间久一些没关系吧？显微镜下观察时材料总是不清晰，聚焦很模糊，感觉不在一个层面上（切得4um）

limeiying

我们通常用的封闭液都是10%二抗同种属血清或者1%BSA，4度孵育过夜。石蜡切片厚度通常3-5um。

moluxingke

回答：1 材料容易皱缩原因可能是因为组织本来含水多，脱水后皱缩，也有是固定过久，还有就是脱水过程时间没有控制好。
4 O8 C' ?" s6 v6 [, G) q      2 HE染色退色一般是伊红容易退色，而苏木素用自来水洗涤的时候容易变得较蓝一些。伊红退色有可能是伊红用太久了，换新的，或是你伊红染过之后就不要冲洗了，直接在100%的酒精中洗涤过，然后二甲苯洗涤 封片。5 ]7 Z8 y( c% ]/ {4 L) [: N, j
3 材料脱离载玻片？不是太明白你的意思，一般来说，载玻片需要预先处理过的，比如多聚赖氨酸，主要是用来防止组织脱片的。6 I) k4 L& U* ?# h5 q
4 可以用BSA代替，一抗连接太久容易出现背景色，尤其是石蜡切片做免疫组化的时候。
* O/ }% o5 J* ~& G. K5 聚焦模糊，不在一个焦面上原因可能是你的切片没有贴好，组织本来就不在一个面上，另外就是你封片的时候，封片剂没有涂匀，建议是封片后，用镊子稍微夹一下，使载玻片和盖玻片之间的距离尽量均匀一些，
1 m0 z8 q" I+ C( K( E& w; o不知道有没有回答好你的疑问。

yeshch

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/ l( M! G2 t% r4 m7 @3 ?2 A四度过夜不是一抗吗？你们封闭过夜？

yeshch

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( _  h/ O' p* N0 Z/ a非常感谢你的回复！还有疑问：固定过久会皱缩？我的材料是脱水后皱缩的；按道理应该二甲苯透明后就该恢复了，至少浸完蜡也该不皱缩了吧？伊红问题不大，主要是苏木精返蓝后褪色比较严重，导致染色很浅；你们伊红染过不用95%脱色吗？其他的我再改进一下吧，多谢咯！

moluxingke

回复 yeshch 的帖子# r, u* _. r; f( D. l  i& h
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组织脱水皱缩后很难恢复的，二甲苯主要是把酒精替换下来，浸完蜡也只是替换一下二甲苯，组织丢失的水分不会回来了。苏木素褪色？我很少遇见，我碰到的情况都是苏木素然后之后，自来水反蓝，会变得更蓝，没有见过褪色，所以我不知道是不是你苏木素有问题，或者说你苏木素染色过后，酸乙醇分色太久了，导致褪色严重，如果是这种情况，那你酸乙醇分色时间稍短一点。4 y" U  P' O4 z( G1 \
伊红好像本来就是溶解在95%酒精里面的，我们就把伊红当成95%酒精脱水了，后面再加一道95%酒精，如果觉得伊红染色过重，就在95%酒精里面多放一会，否则时间就短一点。

goblinwang

苏木素染不上色，是有可能的，我遇到的情况是苏木素重新配置后，及好多了，至于脱片，是不是你切片后80度烘烤2小时，的时间不够啊

limeiying

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& |; ]9 T3 S' [' ~! K% b1 {$ ?2 \
通常室温封闭1h

yeshch

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9 e1 i: D5 O) q
  _. S$ v, O: E3 l受教了，可是别人说他们的组织脱水皱缩经过后面的步骤又变的坚挺了

yeshch

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80度？！我们都是62度，或者37度过夜