慢病毒载体感染得到的阳性细胞株，传代后阳性率降低？

Yorkshining

如题，利用慢病毒载体构建基因过表达的细胞株，首轮感染后阳性率近100%，传3代后，阳性率降了一半，理论上慢病毒载体应该是稳转的啊，为什么阳性率会降低呢？载体带抗性基因，药杀浓度已经摸索好了，如果要得到稳定表达细胞株，转染后是直接加全浓度的药物，还是半药浓度的啊，一半杀多久啊，求指点，非常感谢！

weiyepan

你筛过单克隆没有？

Yorkshining

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% G6 K7 J+ v' _% O! ~0 y) Q4 \* }9 r. p* Z/ v" s
没有，我理解的病毒感染应该是稳转啊，怎么会随着传代阳性率降低呢，求解释。。。

goast8

1、药杀浓度应该用全浓度吧
8 q% p( q  [, o. W2、即使是稳定转染，也会丢失。
+ j4 l4 J1 ~9 E1 o& i3、一般病毒转染不用挑单克隆，但建议转染完检测后及时大批量保种，这样对稳定代次的要求就低一些。

Yorkshining

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8 ]: K- d; R4 w( \- D: V1 V( d3 V! n4 w( k3 S5 @1 D
非常感谢您的回复，那么一般传多少代就可以检测了啊，以多大的比例传代呢？后期培养的过程中是否需要始终用半药维持呢？

weiyepan

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9 G( x& u0 _: V/ z8 ?
2 o/ `, d, O  u. e* L) F6 V慢病毒表达本来就不高，因为病毒里面没有polyA信号mRNA不稳定。伴随着随机插入会中断细胞一些蛋白的表达。MOI太高的话，转进去拷贝多的克隆会长的慢一些。随着细胞倍增，MOI低（表达量低）的占比会越来越高，表现出来就是pool的表达效率下降。
  p' e. ?5 ?' h" b& a9 M所以要得到稳定高表达的细胞株，还是需要筛一下单克隆。