请教脂肪干细胞流式鉴定

weychui

小弟分离培养脂肪干细胞传代4次左右，准备做流式细胞鉴定表型，由于抗体隔两三个星期才到货，于是就把细胞先-80冻着了，现在准备鉴定，请问一下大神们，将细胞复苏传代一次就可以上机鉴定吗？需要注意什么？还有下面是我的protcol，我看了一些文献，有的说需要用多聚甲醛固定，有的没说，请做过的支招，到底需不需要啊？意义在哪里？非常感谢！！6 G, E# [- T5 m1 u3 y9 k( F' F
下面是流式鉴定的protocol，大家看看有没有问题：
( o$ ], u2 y( }, [2 {   1.取ADSCs 胰蛋白酶消化后，调整浓度为1×10的6次方的细胞悬液5 d% }! A8 m0 e4 M6 I) v9 |
   2.分别加入抗大鼠CD44PE 、CD90FITC、CD29FITC单抗各1 μL， PE-IgG2a、FITC-IgG2a、FITC-IgG为阴性对照。4 ℃避光孵育30 min + U; M! [- U) m4 t% r! d
   3.加入含体积分数为5%FBS离心重悬两次
" b$ n# N$ X) h/ S* \. ]   4.流式细胞仪检测表面标志的表达率。

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  -80度冻存后复苏需要看细胞活性，最好液氮冻存。是否多聚甲醛或甲醛固定取决于你的目的和流式细胞仪距离你的实验室多远（远的话比如需要坐车才能到达的距离就需要固定，非常近就可以省略固定），另外，如果打算分离有特定表面抗原的细胞就不能固定。* N3 D9 m* Q& {- c' C( O' s
1.取ADSCs 胰蛋白酶消化后，调整浓度为1×10的6次方的细胞悬液（体积打算多少？体积确定了才能决定CD44等的体积）1 i4 H: J$ e$ ?; _
   2.分别加入抗大鼠CD44PE 、CD90FITC、CD29FITC单抗各1 μL， PE-IgG2a、FITC-IgG2a、FITC-IgG为阴性对照。4 ℃避光孵育30 min 7 `& S# I; r' x5 V$ @
   3.加入含体积分数为5%FBS离心重悬两次（我用的是2%，5%我认为也应该可以）$ W2 P+ n) f# c2 G
   4.流式细胞仪检测表面标志的表达率。
/ u# w( g* \6 H3 E" p另外，为什么选这几个maker？MSC至少应该表达CD73,CD90，CD105，缺乏表达CD45, CD34, CD14 or CD11b, CD79a or CD19 and HLA-DR。