Nature：细胞重编程技术的“黑匣子”之谜

yinfuhua

Nature：细胞重编程技术的“黑匣子”之谜
+ ]7 a- A2 U5 Z2014-12-24 1 来源：生物360 作者：筱玥/ : s1 x/ \6 I) D- `" J% J( x
# ?9 M; Y) g6 v5 t  a; `' W
几十年来，科学家们一直致力于研究如何利用成体细胞，经过重编程获得胚胎细胞——直到最近，他们才开始明白其中的机制。
( O* }6 x  ]. e) ?0 k9 Z* \# w. q大自然和研究者们，其实一直都存在或进行着这样的生物学过程。卵子与精子结合即可形成胚胎。20世纪60年代，John Gurdon利用蝌蚪的肠道细胞，制备了具有完全相同遗传基因的青蛙。更令世人瞩目的是，在1996年，Ian Wilmut采用成年羊的体细胞，成功克隆得到了Dolly羊。重编程技术——使已分化细胞重回胚胎细胞阶段，从而得以制备得到各种类型的细胞——已经出现了很多年。
) }" l' {+ _% `但是，科学家们对重编程技术的兴趣迅速升温是在2006年之后，那时，有研究表明，只需通过引入四个基因，小鼠成体细胞就可以被重编程，成为诱导性多潜能干（iPS）细胞。操作如此简单，以至于几乎所有实验室都可以进行。现如今，每年有超过一千篇文章与之有关。科学家希望，能够利用这些多潜能细胞修复受损或者不健康的组织——这一愿望在今年几乎就要实现：一位患有眼疾的女性，接受了由iPS细胞分化形成的视网膜细胞的移植，这标志着首次成功移植重编程细胞到人体内。
% G. x2 j9 y  i% v' L6 _5 I但是，存在一个问题：没有人——包括那些专门研究重编程的科学家们，明确知道这其中的机制。他们唯一知道的是，首先使用的是已分化细胞，最终，他们获得了多潜能细胞，至于这中间的过程，到底发生了什么，俨然已经成为生物学界的一个尚未破解的“黑匣子”。“我们一直想要破解这个谜题，” 京都大学（Kyoto University ）iPS细胞研究与应用中心的分子生物学家Knut Woltjen说。“目前来讲，仍然是个难题，我们所做的这一切，十分复杂。”1 Z* s$ q; K% ~" c  H  F5 v  m  c/ S
干细胞生物学家指出，其中的一个问题是，所使用的细胞，事实上是各种细胞的混合体，处于不同的分子状态。而目前制备iPS细胞的方法，没有统一操作流程且效率低下：最终，只有很少一部分会成为完全重编程的细胞，这其中，细胞之间也仍然存在着细微却不可忽视的差别。此外，在各个实验室，根据细胞培养条件的不同，其重编程路径也会有所不同。因此，这造成了实验结果之间进行比较的难度很大。同时，由于对于混杂在一起的细胞特性知之甚少，将其用于临床，安全与否也是一个问题。
6 a* d) {8 N# j' f但是，新技术的出现开始改变这一现状。通过对单个细胞及大量分子数据的分析，生物学家们已经鉴定出一系列在重编程路径中发生的基本事件。
$ c' Y# A# k6 }$ N' @这周，大胆地命名为Project Grandiose的全球最大的国际合作项目，发布了他们的研究结果。项目中，科学家采用一系列检测，对重编程过程的每一个阶段进行精细的“快拍”式研究，发现了一个和多潜能状态相似的阶段。”这是首次对细胞内的整个状态改变过程，进行高分辨率的分析，“Andras Nagy说，他是加拿大多伦多Mount Sinai Hospital 的一名干细胞生物学家，是Project Grandiose的带头人。”因此，把这个项目形容成‘宏大’，我一点也不会觉得难为情。“$ `9 p+ H$ X% ~" f
但是，如果科学家们想要更好地控制这一重编程的过程，以便轻松获得具有治疗作用的细胞，还需要很多努力。”没错，我们可以获得iPS细胞，也可以引导其分化，但是，我们仍然感觉到，我们对其控制能力不够” ，Jacob Hanna说，他是以色列Weizmann Institute of Science的一名干细胞生物学家。“能够随意控制细胞行为，一定是很棒的想法。想要达到这一目标，就需要我们对这一过程的分子生物学细节有足够的了解。”
' @7 C; c+ l1 T/ L1 n  }. Z核移植
5 G$ {2 ]8 O$ ^  \1 k+ o' B* tGurdon 和Wilmut使用青蛙和绵羊的细胞进行重编程研究时，他们的方法是一样的：都是将已分化的细胞核移植到一个已经去除其自身DNA的卵细胞内。科学家们知道，卵细胞内利用某种机制可以对细胞核重编程，从而使得与皮肤细胞（举例来说）相关的基因关闭，而开启和多潜能性有关的基因，并进一步促发一系列下游级联反应。在那之后接下来的十年里，研究者们发现了很多种不同的重编程方法——将细胞核转移进入受精卵，以及胚胎干细胞——但这些方法，都无法阐明细胞到底是如何进行重编程的。; [$ L6 A) G" c1 s2 Z
直到京都大学的两位科学家，Shinya Yamanaka（山中伸弥）和Kazutoshi Takahashi（高桥和利）成功制备了iPS细胞时，事态才有所进展。他们的研究发现，只需要四个蛋白质——通常在胚胎早期或者胚胎干细胞内表达，就可以对成体细胞进行重编程。更重要的是，这为科学家们提供了简便而有效的研究重编程的工具——从此，他们只需要在培养皿内就可以进行研究了。目前，干细胞生物学家们已经明白，在引入这些蛋白质之后——有些时候，这些蛋白被称为Yamanaka因子——细胞内会出现一系列的重大、大部分可预测的基因表达过程。但是，接下来的几天后，细胞就会进入一个神秘的阶段，在此阶段，细胞不断分裂，但似乎进入了停滞期，它们无法被进一步重编程了。在一周左右之后，只有很少的一部分——大概千分之一——的细胞会成为真正具有多潜能性的细胞。
: P  Y1 a9 S( v5 ~  h) N# o0 O) F. d9 m而这其中的过程是无法被预测的，也就是说，在最开始，没人知道到底哪些细胞会进行重编程，而且重编程过程较为耗时。但是，在某些方面，也是可以预测的。“德国、日本、美国的研究者们的研究结果均表明，他们可以差不多相同的时间内获得iPS细胞，而且细胞比例相似，”哈佛大学的Alexander Meissner说。“有一件事是肯定的，细胞重编程不是什么魔术，其中蕴含着一定的机制。这是个好消息——我们必须要设法找到它。”但是，Meissner也说到，这一研究也”令人感到失望“，因为，年复一年，几乎没有什么新的进展。
: E5 @! A: R/ M1 i6 m从细胞的角度来看，想要扭转完全分化的状态，重获多潜能，是一个十分艰巨的任务，犹如将生物学的自然进程封锁住。就拿成纤维细胞举例来说吧，科学家们经常从皮肤中提取这种结缔组织细胞，作为重编程研究的对象。在这些细胞不断分化的过程中，细胞的DNA不断地赋予它们相应的特征，例如“表观遗传学“标签，化学修饰——加入甲基，或者改变与蛋白质包装有关的组蛋白。这些过程都确保了只有那些与成纤维细胞相关的基因会得以表达。而对于一个突然呈现出好像不断分裂的干细胞才具有的特点的细胞来说，不会发生上述过程，因为这有可能是一种疾病发病的路径，例如癌症。7 }. t9 L( E; J
目前，科学家们使用四个Yamanaka因子，可以改变细胞所处阶段，对起初的48小时内的细胞改变，已经有了较全面的了解。在胚胎干细胞内，这些蛋白质可以激活基因的”多潜能网络”，促使细胞不断增殖。但是，如果这些蛋白质进入到已分化细胞，例如成纤维细胞内，作用就会有所不同。宾夕法尼亚大学（University of Pennsylvania）的细胞生物学家Ken Zaret致力于在进入人体成纤维细胞的前两天内，对这些蛋白质进行定位。他发现，细胞内的染色体通过构型上的改变，对这些蛋白质实施了”物理阻断”，使其无法到达通常的目标基因。
# |' |4 p0 X5 l2 A  b取而代之的，这些蛋白质会移动到染色体上可以到达的区域。有时候，它们会激活基因，导致细胞凋亡；有时候，它们可以和被称作促进因子（enhancers）的远处控制区域结合，促进参与细胞重编程的基因的激活。Rudolf Jaenisch是一名来自麻省理工学院（Massachusetts Institute of Technology）的干细胞科学家，他把Yamanaka因子这种广泛的结合能力称作”混杂模式“。( U+ {/ f, G! H7 l* _$ b( G$ ]+ D" e
其它的一些研究，也发现了在重编程早期，染色体所发生的这些显著的改变。在2011年发表的一项研究中，Meissner的团队发现了一种被称作H3K4me2的组蛋白修饰，可以促进基因表达，会对这些细胞内基因组中1,000个以上的位点造成改变：在多潜能基因上的很多位点上，都出现了上述修饰，而与成纤维细胞特异性相关的位点，则没有这一修饰出现。与此同时，细胞行为也随之有所改变：含有修饰的细胞彼此间距离更近，移动更少。) }) a& }' q: I, a2 Q
我们之前认为，是那四个蛋白造成了细胞内完全的混乱状态，“Meissner说。“但是，第一步是可以被预测的，而且对于所有细胞类型而言，都始终如一。”现在，他几乎可以预测某种细胞类型中，“哪些位点会被激活转录，哪些会被修饰，哪些会保持沉默，”他说。“你可以预测这些，但是接下来会发生什么，仍然无从知晓。”
! A8 m8 m; `$ k/ `" H接下来长达一周几乎停滞的进展速度令科学家们陷入困惑无措的状态。细胞继续生长，有些表达了新的基因，但却并非以预测中或者能够理解的方式进行。就连Meissner 所研究定位的H3K4me2修饰，也在比预测更晚的阶段才开始启动基因表达。“大部分细胞会达到部分重编程的状态，而有些则不仅限于此，但我们并不知道为什么，” Meissner说。“这无异于一个研究中的‘黑匣子’。”但是，我们知道，如果细胞开始产生Sox-2蛋白，说明整个过程仍在进行。“一旦Sox-2开始表达，一切都将按部就班地进行，” Jaenisch说，他对重编程研究进程中的个体细胞内将近50个基因的活性进行了检测。几天后，Sox-2及其它多潜能相关的转录因子的数量都将增加。3 _9 V! V8 C# ^3 |" Y
但是，为什么这个过程需要花费这么长时间，而且只能在这么低比例的细胞内出现？“我们不明白，为什么这个过程不能更快地进行，” Woltjen说。他猜想可能是由于细胞需要经过若干轮分裂过程，每一轮都需要至少半天时间，来重塑其表观遗传学状态。“可能这是其中一个限速因素，”他说。
6 f. r2 m3 D$ L0 S: RYamanaka为低转化率提供了一些可能的解释。其中之一是，进行重编程的细胞，在最开始是各种细胞类型的混合。例如，用来提取成纤维细胞的组织，可能本身就含有很多具有细微差别的细胞；即使是成纤维细胞，在蛋白质及其它分子的组成上，可能也会有差别。此外，在培养基内生长的细胞，经常会在不同的细胞成长阶段之间转换。这意味着，诱导重编程的因子对每个细胞的影响是有所不同的。“对某些细胞具有作用的因子，可能并不会影响其它细胞，” Yamanaka说。细胞培养方法的差别，以及与临近细胞之间的关系，这些因素同样会有相应的影响，而且，想要控制所有这些可变因素是很困难的，他补充道。“不可能达到完美，让细胞像军队一样整齐划一。”5 Y4 N% O; m. |5 d, {) F6 k6 e9 ^
研究者们现在正努力对获得的细胞类型进行划分，并对重编程技术进行分析，试图找到细胞“分道扬镳”，走向不同分化道路的方式以及地点。例如，Woltjen已经发现，重编程因子的比例会影响最终获得的细胞类型。某些条件具有更高的成功率，但是结果却只能得到部分重编程、不稳定的状态；另一类条件的转化率低，但是可以获得高质量的iPS细胞。3 p% Y1 O$ q( [
Project Grandiose的研究结果也表明，不同的重编程操作流程条件设定，会影响最终获得的细胞类型。该项目是在2010年，由来自八个研究机构的30多位资深科学家一起开创的，主要是受到Nagy想要解开重编程“黑匣子”之谜的驱动。“我想知道，那个神秘的‘黑匣子’里到底发生了什么，”他说。在使用Yamanaka因子激发重编程进程开始之后，该团队连续一个月，每天收集1亿个细胞，对其产生的蛋白质及RNA、甲基化状态等进行分析。仅仅是甲基化分析一项结果，就可以获得海量数据，可供全世界的研究者们共享使用。项目的规模使得项目的名称——Project Grandiose算得上实至名归，Nagy说。“事实上，当我想到我们最终会获得的数据量时，这个名字就蹦到我的脑海里来了，”他说。
; g) d8 {, t& }& O9 Q一类独特的细胞
! W' A  i; ^7 F最为引人注目的发现，是一类被称作F级细胞（F-class cells）的多潜能细胞，名字的由来是因为此类细胞克隆毛茸茸的边缘。此类细胞的制备方法，是在iPS细胞制备方法上稍作改动而来的：在几天后，按照操作流程，本应阻止重编程因子的表达，但研究者们继续保持这些因子的表达状态。“正是这样，获得了新的一类细胞，”Nagy说。9 c( V* _- q  A! \/ w: D
F-class细胞与iPS细胞有所区别，主要是因为其不能通过多潜能性细胞检测中最严格的一关：将这些细胞注入小鼠胚胎，最终发现这些细胞无法形成嵌合体小鼠组织的一部分。正是由于这个原因，有些人指出，F-class细胞可能只不过是之前被称作“部分重编程”的细胞。但是，Nagy表示，细胞并不是一定要通过这个检测，才能证明其多潜能性，而且还列举了F-class细胞在其它方面所显示的多潜能性：例如，它们可以形成畸胎瘤，畸胎瘤的特点就是含有各种分化阶段的细胞。1 q* H- |3 v* d) V$ l' u
Nagy指出，有些研究者忽略了F-class的存在，是因为他们只是把目光集中在寻找与胚胎干细胞相似的细胞上，而他的研究团队则并没有被“期待中的多潜能细胞应该具有怎样的性质”这样的刻板思维所左右，而是做到了客观地观察、记录。他认为，应该还有更多的多潜能状态需要被发现，“这是一个十分重要的概念，正向我们打开另一扇大门，”他说。
6 ^2 a, I: A6 U. k9 X( u: T* q( b' j所有这些研究，对目前细胞重编程研究领域的核心争议来说，都无异于又添了一把火：重编程过程是否本身就具有随机性和不可预测性？直到最近，大家才就此基本达成了一个共识：答案是肯定的。基于这一随机模型，当重编程因子启动分子的级联反应后，有些细胞进入重编程状态，有些则不会，而细胞到底如何选择，是无法预测的。( K! S" e8 s8 t1 ]) O4 O
但有些研究，其中也包括Hanna所进行的，其结果表明，重编程方法可以进行一定的改变，从而使过程更加高效——这也说明，这一过程中的随机性是可以控制的，甚至是可以消除的。这些研究结果显示，细胞重编程可以从随机模式切换到确定的路径，在该路径中，每一步都是可以预测的。. J) Q+ m( A$ S2 l8 m: v
目前，很多科学家认为，重编程过程既包括确定的阶段——开始和结束时——也包括随机的阶段，也就是出现在中间的那一周神秘期。Hanna将争议的两种看法摆在一起，发现两边并没有互相矛盾之处。“我认为，并不存在随机模式与确定模式之间的竞争。”他把细胞重编程比作是“抛硬币”：每次抛出，结果都是随机的，如果抛出硬币100次，你会发现，得到硬币正面和反面的几率几乎各占50%。同样地，一个细胞是否会进入重编程状态，也是随即决定的。但是，随着时间的进行，一个重编程方法应该会得到某个确定的百分比——也许是10%——每次进行该操作，都能得到类似的转化率。Zaret指出，进行更多的试验，也许可以给争议带来确切的答案，关键是弄清楚在中间的“黑匣子”阶段，到底发生了什么。  M& |# C! K6 R, H6 J
对Zaret而言，针对重编程的争议，让人们开始关注一个更重要的问题：生物学中的秩序，是如何从随机中建立起来的。“细胞的系统首先是建立于天生固有的背景噪音及随机事件上的，这些事件最终又决定了细胞的分化方向，并使其固定在某个状态，而不会随意改变，”他说。这个问题是细胞类型控制的基础，他说，并且吸引着他进行相关的研究。; A7 p, a/ g# \( z  g" ?6 ?" O& Z
对其他研究者而言，例如Yamanaka，解开“黑匣子”之谜的目标很实际。更加高效的重编程方法，可以让研究者更好地进行试验，并且可以确保今后用于人类疾病治疗的细胞来源更加可靠。“我的研究动力，一直以来都是能将研究结果应用于临床治疗，”他说。“任何可以将iPS细胞推向临床应用的可能性都会令我为之一振。”
5 U2 N- c$ p6 |- A& c% q原文检索：
9 i, g& r$ ]( ]# UDavid Cyranoski. Stem cells: The black box of reprogramming. Nature, 10 December 2014; doi:10.1038/516162a* r$ T/ p+ s! p3 s- C

FreeCell

嘻嘻，打开细胞重编程的黑匣子等于破解了癌细胞发生机制