AdvCell® 免疫细胞优化培养基

佰通生物

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       AdvCell® 免疫细胞优化培养基﹙BICSFM0003﹚的核心是采用无血清替代物及细胞培养优化添加物为细胞提供一个营养全面和平衡的环境。产品适用于人及哺乳类动物免疫细胞的培养,包括T、DC﹑CIK、NK等细胞的研究及应用。通过添加不同的细胞刺激因子，可高效快速扩增相应的免疫细胞。

★  产品号   
     Cat No : BICSFM0003

★  产品内容
名称                                                                                 产品号                  规格             储藏条件            运输
AdvCell® 免疫细胞基本培养基
AdvCell® Immune Cell Base Medium                                BICBM0001         500 ml             2-8℃/ 避光           冰袋
AdvCell® 免疫细胞添加物A
AdvCell® Immune Cell Culture Supplement A                BICS0001A         20 ml             -20℃/ 避光           干冰
AdvCell® 免疫细胞添加物B
AdvCell® Immune Cell Culture Supplement B                BICS0001B         1 ml                     -20℃/ 避光           干冰
AdvCell®  细胞培养优化添加物
AdvCell®  Cell Culture Opti-Supplement                        BCOS0001         5 ml                     -20℃/ 避光           干冰

★ 产品适用范围
    适用于人及哺乳类来源的免疫细胞包括T、DC、CIK、NK 细胞的培养。

★ 培养条件
    37℃，5％ CO2  无菌恒温培养。

★ 操作步骤
    以下过程作为常规免疫细胞培养的一般准则，如需在生物反应器或培养袋中高密度培养，应优化条件来确定最佳的操作步骤，BICSFM0003中各组分（BICBM0001、BICS0001A、BICS0001B、BCOS0001）在使用前37℃解冻之后混合。

【T 细胞培养】
1.准备新鲜的外周血单个核细胞（PBMC），或根据标准的外周血单个核细胞解冻程序，在37℃的水浴，快速解冻（〈1 分钟）冻存的外周血单个核细胞。
2.用生理盐水洗涤细胞，根据需要也可加入2-5％热灭活的人自体血浆。
3.用电子（即 Coulter 计数器，VI-细胞）或手动的方法（即血球计数仪）给细胞计数。
4.离心细胞，清除洗涤缓冲液。
5. 加入用AdvCell® 免疫细胞无动物源培养基﹙BICBM0001）培养，培养初期，用含细胞因子（如IL-2）的培养基重悬PBMC，CD3+ T 细胞密度保持在大约0.5-1×106/ml，转移细胞到相应的细胞培养容器（培养袋、培养瓶）。随后可应用各种操作激活 T 细胞，包括添加刺激的抗体或抗原呈递细胞。无论培养T 细胞的规模大小，细胞均可被隔离，激活和扩大。
6.在37℃，5％CO2 的潮湿培养箱中培养细胞，给予并维持细胞在对数期生长所需要的营养。为了保持细胞在对数期的增长，当细胞密度超过1×106/ml 时，需要分离传代，维持细胞密度在0.5-1×106/ml（例如，2×106个细胞/ml 以上，按1：4 比例0.5×106 细胞/ml）。在静态平板培养中为了获得最佳的气体交换，建议培养基深度不超过1 到1.2 cm。

【单核细胞树突状细胞﹙DC﹚培养】
1.准备新鲜的外周血单个核细胞（PBMC）。
2.将外周血单个核细胞铺在培养瓶中，加入适量 AdvCell® 免疫细胞无血清培养基（BICBM0001）。
3.在37℃，5% CO2 的恒温培养箱中孵育2-3 小时。
4.弃掉含非贴壁细胞的培养基。
5.用生理盐水洗涤贴壁细胞（主要是CD14+单核细胞）三次。
6.添加重组人IL-4 和重组人GM-CSF 到 AdvCell® 免疫细胞无动物源培养基﹙BICBM0001），至终浓度分别为50～100 ng/ml 和50 ng/ml，并以此培养基培养贴壁细胞。保持细胞度在1～3×105 细胞/cm2 之间。研究者可视情况加入灭活的人自体血浆。
7.在37℃，5% CO2 的潮湿培养箱中连续孵育5天，建议培养3天左右已添加了IL-4 和GM-CSF 的 AdvCell® 免疫细胞无动物源培养基(BICBM0001)换液，换液过程保留贴壁和不贴壁的所有细胞。
8.培养6天之后，细胞表现出典型的树突状细胞的形态和表面标记（细胞CD1a、CD80、CD86、HLA-DR）。
9.向 AdvCell® 免疫细胞培养基(BICBM0001)中添加1 ng/ml 的LPS 或者50 ng/ml 的TNF-α诱导的树突冠状细胞的成熟。

【CIK细胞培养】
1.将采集的外周血收集到2支离心管中，2000 rpm/min离心5 min，弃上清，将沉淀细胞混合，到加生理盐水至25 mL，使沉淀细胞充分悬浮。另取1支离心管，加入淋巴细胞分离液20 mL，用滴管将血细胞悬液缓慢转移至淋巴细胞分离液的表面，使二者之间形成清晰的界面。
2.2000 rpm/min离心20 min 后，从管底到液面分为4层，依次为红细胞和粒细胞层、淋巴细胞分离液层、外周血单个核细胞层（PBMC层）、血浆层。用吸管将PBMC层吸出，转移至另一支离心管中。
3.加生理盐水至40 mL，1500 rpm/min离心5 min，结束后弃上清，将沉淀细胞悬浮，加入生理盐水至40 mL充分混匀后，1500 rpm/min离心5 min。如此共离心洗涤3次。
4.最后一次离心结束后，弃上清，将沉淀细胞均分为3份，分别转移到3个培养瓶中，各加入40 mL的免疫细胞无血清培养基（BICBM0001）培养，分别记为A1、A2、A3。
5.2h后取出培养的细胞，分别将A1、A2和A3中悬浮的淋巴细胞转移至另3个培养瓶中，分别记为B1、B2、B3。3个B瓶中加入IFN-γ，第二天加入IC因子（含有IL-2和抗CD3单抗），诱导培养CIK；3个含有贴壁细胞的A瓶中各加入40 mL 的免疫细胞无血清培养液和H1、Hb因子，诱导培养DC。
6.DC培养过程中，如有发黄，则换液，补加H1和Hb因子。
7.CIK培养过程中，如发现培养液发黄，则换液，换液后补加IL-2。如发现有细胞团块结为不良絮状，则用离心管收集后静置沉降5 min左右，待絮状物沉淀后，小心将上清细胞悬液倒回培养瓶中。
8.DC于第7天加入肿瘤抗原和TNF，第8天铲下收集后与相应的CIK混合共培养。DC瓶弃去。如果总的细胞量过于庞大，也可将DC和CIK混合后均分到A和B瓶中。
9.共培养的DC-CIK于第10天做微生物检测。
10.细胞悬浮液的制备：培养结束后，将培养瓶中的细胞悬液用离心管收集，1500 rpm/min，5 min离心洗涤3次，将25 ml白蛋白加入250 ml盐水中，终浓度1%，加入细胞沉淀，配成细胞悬液。

【NK细胞培养】
1.抽取患者外周血50 ml，将采集的血样转入50 ml 离心管，2000 rpm离心10 min。
2.离心结束后，用移液器吸取上层淡黄色血清于新的 50 ml 离心管，盖好离心管盖于 40℃水浴锅中孵育30 min。
3.孵育结束后，再 1400 rpm(340 g)离心 10 min,吸取上清于新的离心管保存 4℃备用。
4.用移液管将下层的血细胞与生理盐水 1:1 混匀，按 1：1 将悬液缓慢加入装有淋巴细胞分离液的离心管（注意：不要打乱液面分界保持液面分层明显）。
5.将离心机的升速与降速调至最低，400 g 离心 30 min；离心结束后，用 5 ml 移液管吸取中间白膜层于新的 50 ml 离心管，并用生理盐水洗涤离心两次，以去除多余血细胞。
6.根据计数结果调整细胞浓度，充分混匀后按 1- 2×106/ml 密度接种于含免疫细胞无血清培养基（BICBM0001）的培养瓶中，并添加相关NK细胞活化及增殖的相关因子，这些相关因子包括anti-CD3、 IL-2、 IL-4、 IL-5、 IL-12、 IL-15、 retronectin。 其中，anti-CD3、IL-2、IL-4、 IL-12为必选因子，浓度根据具体情况调整。
7.当细胞生长到第三天离心换液 （ 340 g离心10 min ）更换新鲜培养基及相关细胞因子。
8.以后 4-6 天每天镜检观察，根据细胞悬液颜色添加培养液，每次添加应为总体积的三分之一左右。
9.第七天计数，当细胞量大于 6×107 时，则需加入扩增试剂，如细胞数量在 3-6 ×107 时，则长至第八天在添加 NK 扩增培养试剂，加液时使总细胞浓度保持在 1-1.5 ×106cell/ml。
10.当培养液体积大于 150 ml 或细胞数量大于 1.5 ×108 时则需转移至培养袋培养（气泡尽量排空，以免影响细胞生长）。
11.第 8-11 天每天镜检观察计数，根据细胞悬液颜色加培养液。第 12-14 天观察需加液 时，细胞浓度需保持在 2 ×106cell/ml。
12.当细胞达到所需剂量时，即可离心收集细胞待用。