[经验心得] 细胞培养常见问题及回答

梦茹

1.如何选用培养基？ & a3 e& o" H& g. x' B5 z- m3 ]2 O, N, G
培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养，各种目的无血清培养的首选是AIM V培养基（SFM）。在开始进行新的细胞培养时，可以参考下表所列的条件： 细胞系 细胞类型 种 组织 推荐使用的培养基 3 C. h9 K1 \" D! d+ n
293 成纤维细胞 人 胚胎肾 MEM, 10% 热灭活马血清 ' }/ r8 t& `- Y8 w7 W
3T6 成纤维细胞 小鼠 胚胎 DMEM, 10% 胎牛血清
' D" j3 S6 Y- Q+ ^$ O* J" CA549 上皮细胞 人 肺癌 F-12K, 10%胎牛血清 - g) g+ \) D) G! T. |" M3 m* b: C* E
A9 成纤维细胞 小鼠 结缔组织 DMEM, 10%胎牛血清 , r8 z3 A( t% j& S
AtT-20 上皮细胞 小鼠 垂体肿瘤 F-10, 15% 马血清和2.5% 胎牛血清
. Q4 A  O3 O6 G+ u$ A# ?BALB/3T3 成纤维细胞 小鼠 胚胎 DMEM, 10% 胎牛血清 8 C2 K6 v( u- n5 b7 a
BHK-21 成纤维细胞 仓鼠 肾 GMEM, 10% 胎牛血清 或MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA 4 p8 A6 s8 l+ s
BHL-100 上皮细胞 人 乳房 McCoy'5A, 10% 胎牛血清 ' w. T! z; u, w7 r; W/ q
BT 成纤维细胞 牛 鼻甲骨细胞 MEM, 10% 胎牛血清 和 NEAA
; L; Y8 T' U8 G3 q9 R$ J9 @Caco-2 上皮细胞 人 结肠腺癌 MEM, 20% 胎牛血清 和NEAA
5 Q6 S. Z/ d0 F3 H8 t7 B- G7 LChang 上皮细胞 人 肝脏 BME, 10% 小牛血清 3 K3 A- s1 ^5 I; W
CHO-K1 上皮细胞 仓鼠 卵巢 F-12, 10% 胎牛血清
8 B( m6 d7 g( h) P, a4 ?& y4 _& r( j! DClone 9 上皮细胞 大鼠 肝脏 F-12K, 10% 胎牛血清 % o- O2 t' G2 B1 l! Y
Clone M-3 上皮细胞 小鼠 黑素瘤 F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清 & ^- w1 h% n. K6 L# }; ?
COS-1 成纤维细胞 猴 肾 DMEM, 10% 胎牛血清 / s0 W9 }- ^3 w5 ]* j  j) X% {7 n
COS-3 成纤维细胞 猴 肾 DMEM, 10% 胎牛血清 2 f. @+ o; @' v8 Z6 M+ J+ |
COS-7 成纤维细胞 猴 肾 DMEM, 10% 胎牛血清 : ?# G3 q( M$ Y) j# F# A9 G
CRFK 上皮细胞 猫 肾 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
5 q# u+ Y% R+ \) u2 {CV-1 成纤维细胞 猴 肾 MEM, 10% 胎牛血清 3 W# T- j$ _8 n- H2 u) G
D-17 上皮细胞 狗 骨肉瘤 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA ; d( t$ x' ^. Y- `1 ~/ ]
Daudi 成淋巴细胞 人 淋巴瘤病人血液 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
: b0 c( d( D; E1 N- k& EGH1 上皮细胞 大鼠 垂体肿瘤 F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清
- T/ ~. j& Q: c2 F, {GH3 上皮细胞 大鼠 垂体肿瘤 F-10, 15% 马血清和2.5% 胎牛血清
1 T6 E0 p0 a8 {0 ^. T2 x7 pH9 成淋巴细胞 人 T细胞淋巴瘤 RPMI-1640, 20% 胎牛血清
' d+ }  I* T: O( bHaK 上皮细胞 仓鼠 肾 BME, 10% 小牛血清 + m1 [8 @$ {. H* [, v+ t4 c9 V1 l
HCT-15 上皮细胞 人 结肠直肠腺癌 RPMI-1640, 10% 胎牛血清 / Z0 g) U1 S. A$ S& @% p
HeLa 上皮细胞 人 子宫颈癌 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA (in suspension, S-MEM)
: P3 H# \: f; @4 e& L/ m. RHEp-2 上皮细胞 人 喉 癌 MEM, 10% 胎牛血清 ' p! M  m) N8 j4 ?. Y) U% j
HL-60 成淋巴细胞 人 早幼粒细胞白血病 RPMI-1640, 20% 胎牛血清
- {/ P) j- @4 kHT-1080 上皮细胞 人 纤维肉瘤 MEM, 10% HI 胎牛血清 和NEAA 4 f" h8 C: c4 W
HT-29 上皮细胞 人 结肠腺癌 McCoy's 5A, 10% 胎牛血清
, M/ W3 C. y, i3 V5 W' @  bHUVEC 内皮细胞 人 脐带 F-12K, 10% 胎牛血清 和 肝素盐 100 ug/ ml
! [& y8 y! y$ U# [$ ~. CI-10 上皮细胞 小鼠 睾丸癌 F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清 ' z1 V7 }  |& v' e9 X) P
IM-9 成淋巴细胞 人 骨髓瘤病人骨髓 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
7 y# S* f. }' u5 f2 f. I; @6 MJEG-2 上皮细胞 人 绒毛膜癌 MEM, 10% 胎牛血清 . T4 i' g5 B; [- }
Jensen 成纤维细胞 大鼠 肉瘤 McCoy's 5A, 5% 胎牛血清
7 _; Q+ N/ c" l! L; U, g+ i5 hJurkat 成淋巴细胞 人 淋巴瘤 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
3 d( F  u' _, m- O9 T* E  vK-562 成淋巴细胞 人 骨髓性的白血病 RPMI-1640, 10% 胎牛血清 ; D% X# A' p1 y! _6 b$ K& _* s
KB 上皮细胞 人 口腔癌 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA ' u! F/ z0 y* n& Z7 s
KG-1 骨髓白细胞 人 红白血病病人骨髓 IMDM, 20% 胎牛血清 0 \' i9 A: ^8 x. a0 o
L2 上皮细胞 大鼠 肺 F-12K, 10%胎牛血清
0 |# o0 S- N1 u! KL6 大鼠 骨骼肌成肌细胞 DMEM, 10% 胎牛血清
! k8 x1 U: g5 P; ULLC-WRC 256 上皮细胞 大鼠 癌 Medium 199, 5% 马血清 / ~0 s7 G9 T' N6 R1 H
McCoy 成纤维细胞 小鼠 未知 MEM, 10% 胎牛血清 3 U' \' {/ C9 i% x7 F; |0 H3 M/ k
MCF7 上皮细胞 人 乳腺癌 MEM, 10% 胎牛血清 NEAA, 10ug/ml 胰岛素
7 [2 h: W, |  O4 L4 UWEHI-3b 类巨噬细胞 小鼠 骨髓单核细胞白血病 DMEM, 10% 胎牛血清 # C' j, _. D7 o" |
WI-38 上皮细胞 人 胚胎肺 BME, 10% 胎牛血清 3 [' l/ r7 A( [8 Q. D
WISH 上皮细胞 人 羊膜 BME, 10% 胎牛血清
' T) D- r$ x* {( j& o! h3 J8 fWS1 人 胚胎皮肤 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA ( O8 w* }" R4 x$ a# k& ^7 }9 @4 O
XC 上皮细胞 大鼠 肉瘤 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
4 {4 Y* D' X. N2 Y2 c8 p9 vY-1 上皮细胞 小鼠 肾上腺瘤 F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清2 n6 \, e4 I1 C& n% Y0 x9 t1 _
2.为什么要热灭活血清？
5 ~2 H1 ^- C1 ^8 o  G加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。
. k& V. q6 L3 \9 }+ c. z/ b: G
) u0 |9 f. }. t) N4 T( H3.L－谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？
# u, C% `# L( {& p. D1 AL－谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L－谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L－谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终确定。L－谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。 9 G# {& Z$ c% [  h) s: L2 j2 m
, X8 Z" n+ B+ {
4.GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？
- ^3 e2 e, ?* t0 q0 bGlutaMAX-I二肽是L－谷氨酰胺的衍生物，将其不稳定的α－氨基用L－丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L－谷氨酰胺供利用。7 `) N, G5 S+ b
GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L－谷氨酰胺几乎完全降解。 - D. m% D  p2 u3 S* M0 z/ s& ^. G
# b& G7 X% ~0 I- e
5.为什么培养基中可以省去加酚红？ ! F0 _3 N5 U( B& t$ N% o
酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。 7 |' g5 b2 z8 }/ _& ]1 F8 p6 l& o" W
( k$ D+ q3 d0 x. c# e+ f
6.如何用台盼兰计数活细胞？ ! S4 {; I& H  B) H: ], w
用无血清培养基把细胞悬液稀释到200－2000个/毫升，在0.1毫升的细胞中加入0.1毫升的0.4％的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。
: v2 p  t9 e! ?! e
( v0 |7 [& B6 N7.如何消除组织培养的污染？
# f  B$ D( L9 G% R/ Q2 B& M# e" a3 f( Z9 H
当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。
5 T9 V) q* L, O5 t" n高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。, y3 W# v+ ]9 U
1 在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。" E( w: x4 |7 B3 d) t; }
2 分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。2 d; _4 d5 n1 h9 V6 Q; \# d
3 每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。9 y6 c$ f. t' e
4 确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2－3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2－3代。. y* c* T: s; p4 Q
5 在无抗生素的培养基中培养细胞一代。" h, L% Q' ]+ T) Z' b2 i# j
6 重复步骤4。3 }$ |& M; k) J" N
7 在无抗生素的培养基中培养4－6代，确定污染是否以已被消除。
7 B7 t1 X# V: Z  f' h7 R5 Q  l" ]3 W8 F4 F# k% M* ]2 t
8.培养基中丙酮酸钠的作用是什么？ : ]$ I6 I4 A: s# d% i# P" b
丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源。尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。 * c: V& P- z6 R; s  L6 g

' [3 m9 T$ z# C' I, _6 P9.为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀？ " I4 Y4 L! ~# W* x
GIBICO的胎牛血清 没有预老化，储存在2－8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在－20℃储存胎牛血清，避免反复冻融。 & w% S4 m$ @' _5 M; q0 @

/ X! l: q0 z: [$ A7 h# r' L10.目录上说，Hank’s 平衡盐溶液（HBS）要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？
8 g3 x1 d6 X+ y, w* X+ nHank’s 平衡盐溶液（HBS）和Earle’s平衡盐溶液（EBS）有什么本质的功能差别？ 8 |$ X6 p' Q" w3 L
/ o  A, m8 b' a$ Q+ Y9 S3 T0 p& K
HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平，碳酸氢钠的含量在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。
7 f6 t  S3 `7 u$ v- F. t8 R  ^/ t( X, ?4 Z
11.Qualified和 Certified 胎牛血清有什么差别? : I- H! k" U/ |* d5 V: t" o5 ^5 |5 ~
Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清执行的所有的标准检验程序，而且除了这些标准检测，Certified胎牛血清还有如下一些附加的检测：
5 l% g# n( {# L& T, O" v  hEnd-Point Determination of Endotoxin Content
8 L3 p% i# S$ ]2 Y噬菌体检验
# P4 E7 `+ M0 e" |生物化学检测 4 w% b) p) t- u: `9 C# `, _! E2 y
激素的检测/ R3 s* |# C& ^
血红蛋白检测
6 b7 c! M/ Q, J- N3 `$ BSf9 细胞生长促进及方法学检测 % j5 `$ ^( Q) l

# a( [8 W* d" C# P  U12.二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？ ! _( O$ `$ C7 U; O5 j1 W  K
二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。; S( \! Y  l" i
13.制备 lipid-DNA的方法会影响转染效率吗？
( G; H$ C1 E% f' J是的。对于LIPOFECTAMlNE Reagent，稀释试剂在100μl OPTI-MEM中，稀释DNA在100μl OPTI-MEM中。混合两种溶液在室温下孵育15分钟。对于LIPOFECTIN Reagent，在加入DNA溶液前允许稀释的试剂和培养基孵育至少30分钟可以增加3倍的效率。确保复合物在没有血清的情况下形成。孵育15分钟后，在复合物中加入含有血清的培养基（800μl）。（注意以上是35mm培养皿使用体积）。对于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA应该在与脂质体混合之前首先与Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000的操作步骤允许在一个很小的体积下混合DNA和脂质体，接下来可以不需要换培养基的情况下直接加入。对于每一种脂质体的详细的信息可以参考产品说明书。 ! L; P- K- z1 [& f4 r
) Y0 d; E. D5 g2 |1 G3 h+ b- r
14.我使用SF900 Ⅱ时，细胞生长良好，但是为什么我的蛋白产物不如使用Graces 液和10%胎牛血清时效果好？ , [) p6 B+ @: |  f! A( L
如果目的蛋白是一个后期蛋白，它将与蛋白酶一起表达，这些蛋白酶将会作用于目的蛋白。在加有血清的培养基中，这些蛋白酶将作用到血清中的蛋白，从而使目的蛋白产品保持完好。在无血清配方中，蛋白酶作用的唯一底物是你的目的蛋白。为了避免这一问题，加入一些蛋白酶抑制剂或加入少量的血清（少于1％），让血清给蛋白酶提供作用底物。
' h6 E4 b: ?& l# k  p: U# ?. ?$ m% D9 S3 p; h: V) }
15.如何检测内毒素(热源)水平？ ! V- F( H* l! u% H* m+ o
LAL（Limulus Amebocyte Lysate）试验是可用的最敏感和特异的检测细菌内毒素的方法。Levin和Bang 发现细菌可引起鲎（Limulus polyphemus）血管内的凝集作用。内毒素启动一个细胞内酶原系统（丝氨酸蛋白酶级联反应系统），通过修饰凝集素，产生一种透明的胶，LAL中的凝固蛋白，从而，形成不可溶的基质。LAL试剂缓冲的鲎（血细胞）裂解物。7 _! }# ]2 X& v  }
胎牛血清的内毒素检测是在Grand Island，按照手册上Gel-clot 方法进行的。在对血清产品进行内毒素检测前，用无热源的水1：10稀释样品。稀释样品沸水育5分钟，以消除抑制剂。（通常，血液中的内毒素结合成份的出现会抑制凝胶过程，使内毒素不能与LAL反应。样品预先热处理可以消除这种抑制作用。）
+ z) g  _  Z" Q" [& N; }- O  P5 w8 c- V( g+ N7 _* h# I' l4 O
16.我可以使用固体形式的Murashige Skog 培养基吗？
6 I) Y- V; t4 i如果使用固体形式的培养基，需要加入琼脂。琼脂加入前要先灭菌。应该避免MS培养基的直接灭菌，应该高压灭菌琼脂溶液，然后把融化的琼脂溶液加入到MS培养基中。 ) C% ~) U7 M6 Z; v# ?

: L* F3 v4 @. J9 V- G  |9 E( k  o17.20℃下配制的缓冲液，在较高或较低的温度下PH值会改变吗？
1 I( o/ \) B: N对于普通使用的缓冲液，PH值随温度变化而变化。2 R1 k4 Y  b2 ]7 ]- E! W  S6 Z6 h
下表列出温度改变10℃时，PH值的变化情况7 H) I" r  A. S4 V8 w$ h
例如 20℃下配制PH7.4 Tris缓冲液,40℃时PH值为 7.4-（2x0.310）＝6.78  Z2 ]" {" W& d0 j) W: T& Q1 w+ ]  T
缓冲系统 pKa/20℃ [Delta]pKa/10℃ ! j, I! D7 s: k7 R
Mes 6.15 -0.110
1 Q- C& N* _! S. s/ i% [! l" A+ @# PAda 6.60 -0.110 ; m8 Y  D; e0 v4 H( s1 e4 t$ |
Pipes 6.80 -0.085
8 O" B+ o: ]& K" \8 }- N7 YAces 6.90 -0.200
' V$ O' Z$ G4 }Bes 7.15 -0.160 8 H2 s, C. @1 ^
Mops 7.20 -0.013 ; z# v3 X4 B% m  P! g+ {$ e) l" z3 N
Tes 7.50 -0.200 # o4 c1 O4 N; |; S, P- K
Hepes 7.55 -0.140 * `% I6 j) F, [+ \2 x* P  `3 m
Tricine 8.15 -0.210 4 d/ X3 z4 f' F$ m" Q6 |# e9 `
Tris 8.30 -0.310
. w. T+ g9 |5 q0 W' ZBicine 8.35 -0.180 , Y$ W5 `% T5 E! }6 L
Glycylglycine 8.40 -0.280
" l' a* R8 H: E% ~6 j" Y
& P5 I2 i1 ?1 S' k9 c% J& t+ m
- N8 ^$ F; s$ T; `$ K0 A- U18.室温下(25℃)配制的Tris-HCl溶液，在37℃使用时PH值是多少？ 7 h. G; Y& p* g9 k6 D7 {
缓冲液的PH值随温度变化而变化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃时，不同的PH值。2 h$ M3 f7 J9 r& A8 x" @/ Q
4℃ 25℃ 37℃
" P6 y8 o1 H. H# ]8.1 7.5 7.2
. _& R" t! P6 @6 z; F' e8.2 7.6 7.3 . G. {2 M9 N1 E. k; D: W
8.3 7.7 7.4 9 R5 |; G: L8 I+ W! r- k' i5 W
8.4 7.8 7.5 5 f6 o2 _9 O7 G4 i% z
8.5 7.9 7.6 7 b9 E4 K1 ]; c) L8 B6 u
8.6 8.0 7.7 . g1 N* {7 t3 J  b! Y; ~( U: u! d
8.7 8.1 7.8
2 D! `; N' K9 X* Y- z8.8 8.2 7.9
( |9 c& a4 o- z# B% H$ V8.9 8.3 8.0 , a  E( X. W9 A$ j) X
9.0 8.4 8.1 / [9 D6 u0 Q. ~) C
9.1 8.5 8.2 ; r- I/ j2 o" T9 {1 v- b: S: T4 {
9.2 8.6 8.3   y7 ~9 Z' u7 L/ q+ X- j, Y
9.3 8.7 8.4 6 m$ C) w" t3 w4 L6 X* M
9.4 8.8 8.5 % s- E$ F( ^& l7 u" z# o8 d
- W+ v& x8 x; k, @; ^0 N

1 a/ o% {( M! k" m0 R6 K19.昆虫细胞培养的最适PH值和渗透压是多少？ * D/ v, Z* o. J3 P) Q
生长培养基的PH值对细胞的增值和病毒或重组蛋白的生产均会产生影响。对于大部分鳞翅类昆虫细胞系，在PH值 6.0－6.4范围的大部分应用效果良好。培养鳞翅类昆虫细胞系时，培养基的最适渗透压是 345－380mOsm/kg.。为保证可靠和持久的细胞培养方式，减少技术问题，保持PH值和渗透压在以上所列的范围之内。
1 B: z' v; v1 T# Y. j5 d" L* j) I4 s( L  {6 }
20.High Five细胞有任何其它名称吗？
6 h; n7 U% W- x$ Y) m! eHigh Five细胞也被称为Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。 5 k! S6 K8 R$ L1 V
2 K7 m1 V: p& q6 F( T3 M! A6 _
21.PFHM-II 和HYBRIDOMA-SFM之间有什么差别？
4 w& v- `7 X0 j& E9 s, IPFHM-II (Protein-free Hybridoma Medium)是不包含有蛋白质的单克隆抗体生产培养基。如果作为杂交瘤生产培养基使用，PFHM-II可能需要补充低水平的血清。HYBRIDOMA-SFM即是杂交瘤生产培养基，也是单克隆抗体生产培养基。它包含低水平的蛋白质。 ' ?7 A. K  J* F$ ~
/ p: m5 A# i) z
22.在High Five无血清培养基中去污剂的浓度是多少？ , Q, I- @: U3 B" m+ q
High Five无血清培养基中去污剂的浓度：0.025 g/L Tween-80，1.0 g/L Pluronic Poly-all。 4 i! q. O& G  i' ^

% w5 ?0 |1 Q. I  @: b% J23.High Five细胞用多大的密度冻存？
3 v3 u* c7 Z8 W' x3.0x10E6 cells/ml
. ^) U# S4 {  W: i9 a0 Y2 G* A9 n3 b: n( M) ]. t
24.在我的果蝇培养基中发现形成白色沉淀，加热后溶解。它是什么？对我的细胞有害吗？
7 e$ p; L0 n. g& c/ d$ y+ O0 Y! K- h可能是谷氨酰胺沉淀，但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培养基中谷氨酰胺的浓度比典型的2mM高6倍。酪氨酸的浓度比在RPMI 1640中高25倍，而且比谷氨酰胺更加难以溶解。沉淀也可能是不止一种成分的复合物。它可能是由于贮存在局部温度较低的地方引起。只要沉淀在培养条件下可以溶解，对实验不会有不利的影响。 , I- ?! z2 `  ~' e
+ n: P) U' @$ W+ [3 o. r% K2 w
25.如何从T25瓶中转移sf9细胞？能用胰蛋白酶消化吗？ 3 c/ h9 c  ^" `  d- ]& R
我们强力推荐使用脱落细胞的方法，因为这项技术破坏性最小，生活力最高。正如手册上所显示，通过使用巴氏德吸液管，让细胞上培养基流动。作为一种选择你也可以轻轻拍打培养瓶。只有在绝对必要的情况下，才使用胰酶消化细胞。* M0 t' m7 g( ^+ l+ q& u$ O" {
胰酶消化一个T25瓶的sf9细胞：
, K1 L4 E: M8 Y" m1. 去除培养基。1 Z+ c- _, X8 |8 ]
2. 用2ml 1xPBS（足以覆盖细胞表面）洗涤细胞，去除PBS.
6 q9 j+ z& E+ k" R, A" W3. 加入2ml 1x胰酶EDTA（恰好覆盖细胞表面）。& x: F; m! a9 a/ V% M7 i
4. 37 ℃孵育5到10分钟。在仪器下检测看到5分钟后它们正在向上移动。
7 Y4 `9 a" t; H9 p4 V' F* F: M5. 向细胞中加入2ml 细胞培养液，移入锥形管，用2ml培养液洗瓶壁，移入同一锥形管中。（培养基中的FBS终止了胰酶的活性。）4 X* h* X* y! X9 @: b6 {! i
6. 离心（1100rpm）沉淀细胞。去除培养基。
. u) M- b, n$ H; |7. 用新的培养基重新悬浮细胞。传代。
( v, \, f8 T: w; }% D! M# q0 P8 l' ?: C% A" j0 B
26.在Sf9, Sf21, 和high Five细胞悬浮培养时，肝素的使用量是多少？ ( O, `/ u% G, \! |$ S& @( v
为了防止悬浮培养细胞聚集的形成，使用肝素浓度为10单位/毫升细胞悬液。
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27.如何评估ES细胞合格的胎牛血清？
1 g' {/ O# X+ A! D% ~4 R$ g使用D3 ES细胞。这是一个对于胎牛血清中生长促进、生长抑制和分化因子非常敏感的细胞系。
2 F. v  P& H/ R7 q+ }相关生长效率分析：# \) r' M* S, l; y: h( x0 F
当ES细胞以非常低的密度传入包含10％胎牛血清的生长培养基中，检测开始和支持ES细胞克隆的能力。# w: C6 l: o8 C& t1 ^2 z
细胞毒分析：2 d" T7 c2 c9 ]4 c' h3 \5 U7 ]. O5 ~
当以非常低的密度传入包含30％胎牛血清的生长培养基中，检测ES细胞和feeder细胞的生长能力。6 H& ~+ s  X: t1 X5 X! ~( p4 \
相关形态学和分化分析：! v  k0 {4 z. t0 i! J; c
检测胎牛血清支持未分化ES细胞克隆的能力。通过碱性磷酸酶活性评估分化程度。未分化的ES细胞小颜色深红粉红，分化的细胞较大，丰满，颜色较浅。; `3 [. o2 D: z3 A  o
所有的分析在没有ESGRO的情况下进行的，培养基中出现ESGRO会掩盖由胎牛血清所导致的问题。（ESGRO或LIF经常用来保持ES细胞处于未分化状态。）
: u7 k8 @3 W; f+ J9 r" X; n( g经过培养发现，大约8批中有1批可以用来培养ES细胞。) k9 t! {6 ^( r
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28.在重新冻存sf9细胞前，它可以传多少代？随着传代的次数的增加，它的感染能力会降低吗？ ( c5 b* P) G) Y, [# z. p, B
通常情况当细胞经过30次传代后，应该返回冻存。无论什么时候记数时，都应该检查细胞活力。如果超过95％的细胞保持有活力和在大约30小时左右加倍，细胞仍然可以使用。如果活力和加倍时间下降，它们的感染力将不在是有效的。