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成人脂肪间充质干细胞的分离和培养：2 X# g0 b) k4 P7 A6 J% y
成人脂肪组织取自吸脂手术患者,采用吸脂术采集出来的脂肪组织用D-Hank’s洗去血细胞和麻醉药，0.075%的Ⅰ型胶原酶37℃消化1小时，之后用100目筛网过滤除去未消化的组织，1400转/分钟，室温离心10分钟，弃去上清，再用D-Hank’s重悬洗涤2遍（1200转/分钟，室温离心7分钟）以除去胶原酶，最后离心收集细胞。" s$ D+ l c c# T D6 T: g
成人骨髓间充质干细胞的分离：' v+ s) @3 O5 _7 F' d4 ^
。无菌采集健康志愿者的骨髓5-10 ml于无菌的肝素管中，取一无菌的离心管，用D-Hank’s 液适当稀释骨髓后计数，并调整骨髓细胞浓度至107/ml。然后取一新的离心管，分别加入恢复至室温的Ficoll淋巴细胞分离液和上述骨髓细胞悬液，加入时仔细操作勿破坏界面, 二者的比例为1：1。然后再将上述离心管配平后放入常温台式离心机中，以1500转/分钟的速度离心20分钟。取出离心管后，无菌操作仔细吸取白膜层即获得了单个核细胞，将单个核细胞用D-Hank’s液洗涤两次（1200转/分钟，室温离心7分钟）并计数。
' _! @0 X' L* d1 ~! V间充质干细胞（MSC）的接种和扩增培养：
. }7 O% B c8 {细胞以2×106/ml的密度接种，37℃、5%CO2培养箱培养，2天后换液，弃去未贴壁的细胞，以后每3天半量换液。当细胞达70%~80%汇合时，用0.125%胰酶常规消化，细胞按照1：3进行传代，实验中使用2或3代细胞。/ d/ `9 N/ a/ j3 w5 v9 w
& M' V9 L' }: ~5 R/ i; ]# U9 p成肌诱导
8 q2 t9 B* W: Z5 S5 q2或3代MSCs按1×105个细胞/孔接种于6孔板，以扩增培养液贴壁12小时后，换为成肌诱导液培养：DMEM、2% FCS、5%马血清（horse serum，HS）、50 µM氢化可的松（hydrocortisone）和100μg/ml 青霉素及100U/ml 硫酸链霉素。该诱导培养液每3天半量换液。7 h0 \4 G& ?% V) X7 a% i8 a
+ b% A9 V; y4 |6 K# l+ P9 C内皮诱导 U2 W( l( F# T( a8 ^
24孔培养板用Matrigel (factor reduced，BD Bioscience)包被，按5×104个细胞/孔接种MSCs。内皮诱导液为M199、2%FBS、50ng/ml VEGF、10ng/ml bFGF和100μg/ml 青霉素及100U/ml 硫酸链霉素。 |
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发表于 2009-3-20 10:39
