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成人脂肪间充质干细胞的分离和培养：
5 i( s$ S, ?4 E, X. C( ]8 }3 G成人脂肪组织取自吸脂手术患者,采用吸脂术采集出来的脂肪组织用D-Hank’s洗去血细胞和麻醉药，0.075%的Ⅰ型胶原酶37℃消化1小时，之后用100目筛网过滤除去未消化的组织，1400转/分钟，室温离心10分钟，弃去上清，再用D-Hank’s重悬洗涤2遍（1200转/分钟，室温离心7分钟）以除去胶原酶，最后离心收集细胞。
+ b( `5 x) L# p2 U- u) f成人骨髓间充质干细胞的分离：
( o* w. A$ v! Y' J$ L3 Z) ]; D。无菌采集健康志愿者的骨髓5-10 ml于无菌的肝素管中，取一无菌的离心管，用D-Hank’s 液适当稀释骨髓后计数，并调整骨髓细胞浓度至107/ml。然后取一新的离心管，分别加入恢复至室温的Ficoll淋巴细胞分离液和上述骨髓细胞悬液，加入时仔细操作勿破坏界面, 二者的比例为1：1。然后再将上述离心管配平后放入常温台式离心机中，以1500转/分钟的速度离心20分钟。取出离心管后，无菌操作仔细吸取白膜层即获得了单个核细胞，将单个核细胞用D-Hank’s液洗涤两次（1200转/分钟，室温离心7分钟）并计数。
7 Q" Y& O3 Q4 L, ?/ L" F4 V间充质干细胞（MSC）的接种和扩增培养：
& U3 \. ~2 n- g% B) b细胞以2×106/ml的密度接种，37℃、5%CO2培养箱培养，2天后换液，弃去未贴壁的细胞，以后每3天半量换液。当细胞达70%~80%汇合时，用0.125%胰酶常规消化，细胞按照1：3进行传代，实验中使用2或3代细胞。
, d; O6 j+ B/ {2 r6 R+ d6 q
$ t6 x6 \5 N6 N& C成肌诱导
" s3 V9 W! k( y8 a2 I! f2或3代MSCs按1×105个细胞/孔接种于6孔板，以扩增培养液贴壁12小时后，换为成肌诱导液培养：DMEM、2% FCS、5%马血清（horse serum，HS）、50 µM氢化可的松（hydrocortisone）和100μg/ml 青霉素及100U/ml 硫酸链霉素。该诱导培养液每3天半量换液。8 Z2 I: Q7 y1 W
$ t4 W* s7 t8 K1 m# x" x R
内皮诱导 9 A8 R3 q- p4 y% ]5 K
24孔培养板用Matrigel (factor reduced，BD Bioscience)包被，按5×104个细胞/孔接种MSCs。内皮诱导液为M199、2%FBS、50ng/ml VEGF、10ng/ml bFGF和100μg/ml 青霉素及100U/ml 硫酸链霉素。 |
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发表于 2009-3-20 10:39
