AdvCell® 免疫细胞无血清培养基

冷寒星

AdvCell® 免疫细胞无血清培养基（BICBM0001）的核心是采用无血清替代物为细胞提供一个营养全面和平衡的环境。产品适用于人及哺乳类动物免疫细胞的培养,包括T、DC﹑CIK、NK等细胞的研究及应用。通过添加不同的细胞刺激因子，可高效快速扩增相应的免疫细胞。

★  产品号   
Cat No : BICSFM0001

★  产品组成
名称        产品号        规格        储藏条件        运输
AdvCell®  免疫细胞基本培养基
AdvCell®  Immune Cell Base Medium        BICBM0001        500 ml        2-8℃避光        冰袋/常温
AdvCell®  免疫细胞添加物A
AdvCell®  Immune Cell Culture Supplement A        BICS0001A        20 ml        -20℃避光        干冰
AdvCell®  免疫细胞添加物B
AdvCell®  Immune Cell Culture Supplement B        BICS0001B        1 ml        -20℃避光        干冰

★  产品适用范围
    适用于人及哺乳类来源的免疫细胞包括T、DC、CIK、NK 细胞的培养。

★  培养条件
    37℃，5％ CO2  无菌恒温培养。

★  操作步骤
    以下过程作为常规免疫细胞培养的一般准则，如需在生物反应器或培养袋中高密度培养，应优化条件来确定最佳的操作步骤，BICSFM0001中各组分（BICBM0001、BICS0001A、BICS0001B）在使用前37℃解冻之后混合。

【T 细胞培养】
1.准备新鲜的外周血单个核细胞（PBMC），或根据标准的外周血单个核细胞解冻程序，在37℃的水浴，快速
  解冻（〈1 分钟）冻存的外周血单个核细胞。
2.用生理盐水洗涤细胞，根据需要也可加入2-5％热灭活的人自体血浆。
3.用电子（即 Coulter 计数器，VI-细胞）或手动的方法（即血球计数仪）给细胞计数。
4.离心细胞，清除洗涤缓冲液。
5. 加入用AdvCell® 免疫细胞基本培养基（BICBM0001）培养，培养初期，用含细胞因子（如IL-2）的培养基重悬PBMC，CD3+ T 细胞密度保持在大约0.5-1×106/ml，转移细胞到相应的细胞培养容器（培养袋、培养瓶）。随后可应用各种操作激活 T 细胞，包括添加刺激的抗体或抗原呈递细胞。无论培养T 细胞的规模大小，细胞均可被隔离，激活和扩大。
6.在37℃，5％CO2 的潮湿培养箱中培养细胞，给予并维持细胞在对数期生长所需要的营养。为了保持细胞
  在对数期的增长，当细胞密度超过1×106/ml 时，需要分离传代，维持细胞密度在0.5-1×106/ml（例如，
  2×106个细胞/ml 以上，按1：4 比例0.5×106 细胞/ml）。在静态平板培养中为了获得最佳的气体交换，
  建议培养基深度不超过1 到1.2 cm。

【单核细胞树突状细胞﹙DC﹚培养】
1.准备新鲜的外周血单个核细胞（PBMC）。
2.将外周血单个核细胞铺在培养瓶中，加入适量 AdvCell® 免疫细胞基本培养基（BICBM0001）。
3.在37℃，5% CO2 的恒温培养箱中孵育2-3 小时。
4.弃掉含非贴壁细胞的培养基。
5.用生理盐水洗涤贴壁细胞（主要是CD14+单核细胞）三次。
6.添加重组人IL-4 和重组人GM-CSF 到 AdvCell® 免疫细胞基本培养基（BICBM0001），至终浓度分别
  为50～100 ng/ml 和50 ng/ml，并以此培养基培养贴壁细胞。保持细胞度在1～3×105 细胞/cm2 之间。
  研究者可视情况加入灭活的人自体血浆。
7.在37℃，5% CO2 的潮湿培养箱中连续孵育5天，建议培养3天左右已添加了IL-4 和GM-CSF 的 AdvCell®
    免疫细胞基本培养基（BICBM0001）换液，换液过程保留贴壁和不贴壁的所有细胞。
8.培养6天之后，细胞表现出典型的树突状细胞的形态和表面标记（细胞CD1a、CD80、CD86、HLA-DR）。
9.向 AdvCell® 免疫细胞基本培养基（BICBM0001）中添加1 ng/ml 的LPS 或者50 ng/ml 的TNF-α诱导的树突  
状细胞的成熟。

【CIK细胞培养】
1.将采集的外周血收集到2支离心管中，2000 rpm/min离心5 min，弃上清，将沉淀细胞混合，到加生理
  盐水至25 mL，使沉淀细胞充分悬浮。另取1支离心管，加入淋巴细胞分离液20 mL，用滴管将血细胞悬
  液缓慢转移至淋巴细胞分离液的表面，使二者之间形成清晰的界面。
2.2000 rpm/min离心20 min 后，从管底到液面分为4层，依次为红细胞和粒细胞层、淋巴细胞分离液层、
  外周血单个核细胞层（PBMC层）、血浆层。用吸管将PBMC层吸出，转移至另一支离心管中。
3.加生理盐水至40 mL，1500 rpm/min离心5 min，结束后弃上清，将沉淀细胞悬浮，加入生理盐水至40 mL充分混匀后，1500 rpm/min离心5 min。如此共离心洗涤3次。
4.最后一次离心结束后，弃上清，将沉淀细胞均分为3份，分别转移到3个培养瓶中，各加入40 mL的免
疫细胞基本培养基（BICBM0001）培养，分别记为A1、A2、A3。
5.2h后取出培养的细胞，分别将A1、A2和A3中悬浮的淋巴细胞转移至另3个培养瓶中，分别记为B1、B2、
  B3。3个B瓶中加入IFN-γ，第二天加入IC因子（含有IL-2和抗CD3单抗），诱导培养CIK；3个含有
  贴壁细胞的A瓶中各加入40 mL 的免疫细胞无血清培养液和H1、Hb因子，诱导培养DC。
6.DC培养过程中，如有发黄，则换液，补加H1和Hb因子。
7.CIK培养过程中，如发现培养液发黄，则换液，换液后补加IL-2。如发现有细胞团块结为不良絮状，则
  用离心管收集后静置沉降5 min左右，待絮状物沉淀后，小心将上清细胞悬液倒回培养瓶中。
8.DC于第7天加入肿瘤抗原和TNF，第8天铲下收集后与相应的CIK混合共培养。DC瓶弃去。如果总的细
  胞量过于庞大，也可将DC和CIK混合后均分到A和B瓶中。
9.共培养的DC-CIK于第10天做微生物检测。
10.细胞悬浮液的制备：培养结束后，将培养瓶中的细胞悬液用离心管收集，1500 rpm/min，5 min离心洗
  涤3次，将25 ml白蛋白加入250 ml盐水中，终浓度1%，加入细胞沉淀，配成细胞悬液。

【NK细胞培养】
1.抽取患者外周血50 ml，将采集的血样转入50 ml 离心管，2000 rpm离心10 min。
2.离心结束后，用移液器吸取上层淡黄色血清于新的 50 ml 离心管，盖好离心管盖于 40℃水浴锅中孵育
  30 min。
3.孵育结束后，再 1400 rpm(340 g)离心 10 min,吸取上清于新的离心管保存 4℃备用。
4.用移液管将下层的血细胞与生理盐水 1:1 混匀，按 1：1 将悬液缓慢加入装有淋巴细胞分离液的离心管
（注意：不要打乱液面分界保持液面分层明显）。
5.将离心机的升速与降速调至最低，400 g 离心 30 min；离心结束后，用 5 ml 移液管吸取中间白膜层于
  新的 50 ml 离心管，并用生理盐水洗涤离心两次，以去除多余血细胞。
6.根据计数结果调整细胞浓度，充分混匀后按 1- 2×106/ml 密度接种于含免疫细胞基本培养基
（BICBM0001）的培养瓶中，并添加相关NK细胞活化及增殖的相关因子，这些相关因子包括anti-CD3、
  IL-2、IL-4、IL-5、IL-12、IL-15、retronectin。 其中，anti-CD3、IL-2、IL-4、IL-12为必选因子，
  浓度根据具体情况调整。
7.当细胞生长到第三天离心换液 （340 g离心10 min）更换新鲜培养基及相关细胞因子。
8.以后 4-6 天每天镜检观察，根据细胞悬液颜色添加培养液，每次添加应为总体积的三分之一左右。
9.第七天计数，当细胞量大于 6×107 时，则需加入扩增试剂，如细胞数量在 3-6 ×107 时，则长至第八
  天在添加 NK 扩增培养试剂，加液时使总细胞浓度保持在 1-1.5 ×106cell/ml。
10.当培养液体积大于 150 ml 或细胞数量大于 1.5 ×108 时则需转移至培养袋培养（气泡尽量排空，以
  免影响细胞生长）。
11.第 8-11 天每天镜检观察计数，根据细胞悬液颜色加培养液。第 12-14 天观察需加液 时，细胞浓度需
  保持在 2 ×106cell/ml。
12.当细胞达到所需剂量时，即可离心收集细胞待用。