干细胞分离技术——离心分离

马儿

细胞分离就是通过物理、生物、化学的方法，将生物组织分离为单细胞分散系的过程。干细胞分离的方法有很多，离心分离是常用方法之一。
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       离心技术是利用物体高速旋转时产生强大的离心力，使置于旋转体中的悬浮颗粒发生沉降或漂浮，从而使某些颗粒达到浓缩或与其他颗粒分离之目的。这里的悬浮颗粒往往是指制成悬浮状态的细胞、细胞器、病毒和生物大分子等。离心机转子高速旋转时，当悬浮颗粒密度大于周围介质密度时，颗粒离开轴心方向移动，发生沉降；如果颗粒密度低于周围介质的密度时，则颗粒朝向轴心方向移动而发生漂浮。根据离心原理，离心技术又可以分为差速离心法、密度梯度离心法和沉降平衡离心法。而在细胞分离技术主要采用差速离心法和密度梯度离心法。
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1、差速离心法 : O) e9 y& G" F( v+ [8 {
        不同种类和功能的细胞的大小和形状是不一样的，差速离心法就是通过逐步增加相对离心力，使一个非均相混合液内形状不同的大小细胞颗粒分步沉淀，从而达到分离的目的。 : a% b8 @* e% O) W% }" a  f" D4 E
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9 s, l* ?/ f* ~6 E* h2．密度梯度离心法
+ j  O) e% ?" x6 g- Q8 p        用一定的介质在离心管内形成连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。分离活细胞的介质要求：①能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；②PH中性或易调为中性；③浓度大时渗透压不大；④对细胞无毒。
4 S4 U+ D; K8 Z        1）速度区带离心法。离心前，离心管内先装入蔗糖、甘油、CsCl、Percoll等密度梯度介质，待分离样品铺在梯度液的顶部，离心管底部或梯度层中间，同梯度液一起离心，利用各颗粒在梯度液中沉降速度或漂浮速度的不同，使具有不同沉降速度的颗粒处于不同密度的梯度层内，达到彼此分离的目的。本法可分离各种细胞、病毒、染色体、脂蛋白、DNA和RNA等生物样品。
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        2）预制梯度等密度离心法。要求在离心前预先配制管底浓而管顶稀的密度梯度介质，常用介质有蔗糖、CsCl、Cs2SO4等，待分离样品一般铺在梯度液顶上，如需挟在梯度液中间或管底部，则需调节样品液密度。离心后，不同密度的样品颗粒到达与自身密度相等的梯度层，即达到等密度的位置而获得分离。
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( g* f' v0 P7 P2 }2 Z0 W. r        3）自成梯度等密度离心法。某些密度介质经过离心后会自成梯度，例Percoll，可迅速形成梯度，CsCl、Cs2SO4和三碘甲酰葡萄糖胺经长时间离心后也可产生稳定的梯度。需要离心分离的样品可和梯度介质先均匀混合，离心开始后，梯度介质由于离心力的作用逐渐形成管底浓而管顶稀的密度梯度，与此同时，可以带动原来混合的样品颗粒也发生重新分布，到达与其自身密度相等的梯度层里，即达到等密度的位置而获得分离。 7 f- J5 [* o& i
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3．沉降平衡离心法
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( b0 s, h" A3 B: r' _! X# r        根据被分离物质的浮力密度差别进行分离，所用的介质起始密度约等于被分离物质的密度，介质在离心过程中形成密度梯度，被分离物质沉降或上浮到达与之密度相等的介质区域中停留并形成区带。 % ]) P) c3 a! D, K: \* u* b
      
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; o% Z& P3 v1 c+ O+ U       离心技术最关键的仪器设备是离心机。一般认为，一般认为，转速为10~25Kr/min的离心机称为高速离心机；转速超过25Kr/min，离心力大于89Kｇ者称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达100Kr/min，离心力超过500Kg。而干细胞的分离所用离心机的转数大约在5Kr/min.
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瑞士干细胞分离系统是当前国际上最优化的分离设备。 SEPAX细胞处理系统是一种新型的细胞离心分离设备，适合分离骨髓，脐带血，外周血。分离容量在30－880ml,尤其适合儿科小容量骨髓的处理。用于在密闭无菌的环境中对干细胞进行快速自动处理。干细胞成分被收集在标准化血袋中以备进一步处理，如细胞分选，浓缩，洗涤，深低温保藏，体外扩增或给患者干细胞移植。SEPAX系统小巧、轻便并多功能。是血液成分处理的理想平台，具有高回收率和保证处理后细胞高活力。
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       瑞士SEPAX细胞处理系统为干细胞移植治疗及再生医学研发提供安全可靠及重复性好的细胞处理技术。一旦大量进入中国将推动干细胞治疗的大规模临床应用，造福于病人。 0 w& @3 v: J5 U8 m

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       在大批量细胞自动分离的临床使用过程中,胰岛细胞移植COBE—2991细胞分离设备以其优质独一无二的设计,良好的可靠性、稳定性和可操作性、在全球范围内一直处于无可代替的专有设备地位.近年来随着胰岛细胞移植技术在欧美地区的逐渐成熟和临床应用的迅速发展，COBE—2991细胞分离机在胰岛细胞分离、纯化技术设计方面也有专门的设计和配置,包括相关条件的优化(离心条件、细胞分离纯化、温度调节控制)以及专用的分离密度梯度系统和管理吸附收集系统.通过新的配置使COBE—2991细胞分离机能够特异性地对胰岛细胞进行分离纯化.胰岛细胞分离的纯度达85%以上,比通常标准提高60%；胰岛细胞活力达90%以上，比通常标准提高30%,供受体比率降至1:1,从而可大大提高胰岛细胞临床移植的成功率和远期疗效。