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马儿

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发表于 2009-3-25 21:01 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

一：干细胞的冻存技术
      生物细胞冷冻多采用细胞外冷冻，即在细胞外面形成冰的结晶。生物被冷却时，一般首先在细胞外部结冰。但如果冷却速度不特别快，冰的形成就会被原生质膜隔断。而且温度一旦下降，细胞内部的水溶液成为过冷状态，对于位于细胞外面的冰表面的水分子就会产生化学电势差。因此，细胞内的水分会向细胞外的冰表面移动，在原生质膜（或细胞壁）和冰的分界处变成冰。细胞外的冰和细胞之间有水溶液时，从细胞脱出的水可通过浓缩溶液进行二次冷冻。因此，只要继续冷却，细胞就会由于脱水而收缩。在医学和研究领域多采用细胞外冷冻法，即使在温度相当低的情况下细胞也不会致命。但在冷冻前要检查细胞是否为生长旺盛并且存活率较高的细胞，并且在储存前1-2天应检查是否细胞已产生抗体。
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      干细胞冻存法又可以分为玻璃化冻存法非玻璃化冻存法。 3 }* {) t, a, x% B
1、玻璃化冻存
      玻璃化冻存法是指利用各种高浓度的冷冻保护剂联合形成的玻璃冷冻保护液保护悬浮细胞，直接投入液氮进行冻存的方法。以这种方法冻存的细胞悬液没有冰晶的形成。玻璃化冻存法对细胞活性的保存具有较好的效果，其存活率可达90%以上，不要复杂的仪器设备，具有液氮储存设备即可使用。因为玻璃化冷冻保护液中的冷冻保护剂的浓度较高，室温下对细胞具有毒性（但在4℃时毒性大为减弱）。所以，冷冻保护液的滴加全过程必须在4℃冰浴中进行。另外，滴加速度要缓慢，如果滴加速度过快，则在细胞外产生很高的渗透压，造成细胞膜的损伤，导致细胞死亡，故要缓慢滴加，让冷冻保护剂有足够的时间缓慢渗透到细胞内，达到细胞内外的平衡。目前，该方法已在胚胎干细胞冷冻方面得到广泛应用，但很少应用于一般细胞的冻存。这可能与需要配制较复杂的冻存液以及冷冻前和复苏后较烦琐的操作有关。

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2、非玻璃化冻存 ! a( u& h. c6 l
      非玻璃化冻存是用各种温级的冰箱分阶段降温至- 70℃到-80℃，然后直接投入液氮进行保存。或者是利用计算机程控降温以及利用液氮的气、液，按一定的速率从室温降至-100℃ 以下，再直接投入液氮的保存方法。这种冻存方法也能获得较高的细胞存活率。在使用DMSO前，不要对其进行高压灭菌，因其本身就有灭菌作用。高压灭菌反而会破坏其分子结构，以致降低冷冻保护效果。在常温下，应注意控制冻存细胞的质量。既要在冻存前保障细胞具有高活力，还要确保无微生物污染，这样的细胞才具有冻存价值。另外，在每批细胞冻存一段时间后，要复苏1～2管，以观察其活力以及是否受到微生物的污染。冻存管宜采用塑料冻存管，不宜使用玻璃安瓿。因为在复苏时，需要从-196℃的液氮中取出冻存管，立即投入37～40℃温水中，温差很大，玻璃安瓿瓶容易爆炸而发生危险。 # Y% v9 k0 y* @5 x& m( F$ k/ L
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      无论采用那种冻存方法，液氮都是必须的。在使用时选择质量较好的液氮罐十分重要，这里有一些小建议仅供参考。首先，罐子在使用过程中，每天都应随时检查罐子的使用情况，在罐子内有液氮的前提下，发现罐子瓶盖上和上部有水珠或结霜情况，说明罐子质量有问题，应立即停止使用；其次，在罐子瓶盖上和上部无水珠或结霜现象时，用手触摸外壳，感觉上部冷，下部热，说明罐子质量有一些问题，即液氮日增损较大，应注意观察，防止液氮耗损完后，所贮存的物质损坏，必要时，最好停止使用；若上下温度一致，说明罐子质量没有问题。最后，打开瓶塞后，瓶口内的雾气不往外溢，而往下沉，说明罐子是好的。

二、干细胞的复苏
      在实际操作中，冻存的干细胞要进行复苏，再培养传代。冷冻的干细胞之活化原则为快速解冻，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，以避免冰晶重新结晶而对干细胞造成伤害导致干细胞的死亡。干细胞复苏时常用的保护剂有二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透干细胞。干细胞活化后约需数日，或续代一至二代，其细胞生长和特性才会表现正常。干细胞成功复苏后对其活力的影响不大。 + l' f( d# \6 r2 p$ N8 @+ a
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干细胞复苏的主要操作过程如下：
      1.从液氮罐中取出安剖；有时因安剖未封严，浸入了液氮，取出后因安剖内液氮迅速气化而发生爆炸，因此应带有防护眼睛和手套。
      2.迅速放入盛有 36℃～37℃水的搪瓷罐中，扣上盖并不时摇动，尽快解冻。
      3.剪开纱布口袋，取出安剖，用70％酒精擦拭消毒后，净化台上打开盖，用吸管吸出干细胞悬液，装入离心管中，再补加10ml培养液，吹打使干细胞悬浮。
      4.低速离心（500～1000转/分）5～10分钟，弃去上层清液后再重复用培养液漂洗、离心。
      5.加入培养液适当稀释后，再移装入培养瓶中，置温箱培养，次日更换一次培养液后再继续培养。 3 J2 \! N& V8 r. v( [4 D
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在干细胞复苏操作中应注意以下问题: : k3 m' C* g. P3 T
      1、自液氮或干冰中取出冷冻管后，首先要检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。 * u9 A8 `8 l9 F2 R6 O
      2、每批次冷冻和复苏的干细胞的存活率可能会不相同，为避免这个问题，每次细干胞冻存最好分两批以上进行；
      3、一管细胞一般可分装到1-2只培养瓶中，分装过多，干细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。
      4、加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度，如果加入培养基的太少，那么DMSO的浓度就会比较大，就会影响干细胞生长，从很多资料来看，DMSO的浓度在小于0.5%-1％的时候对一般干细胞没有什么影响。所以如果你的冻存液的浓度是10％DMSO的话那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。

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