有关于MitoC灭活mef细胞的那些事，急求。。。。。

qiushuiwuhen

请教各位家友，最近新分装一批丝裂霉素，2mg溶解20mlPBS中，吹打促溶解30min呈现浅蓝色，0.2um滤器过滤后分装，配成100ug/ml的储液冻于-20冰箱，用时用培养基稀释10ug/ml灭活mef细胞2.5hour后，铺细胞第二天发现1/3的细胞都死掉，并且剩下的细胞状态不是很好，换成hes的培养基后不怎么拉丝变长，关键是原来都是这么操作的，铺出来的feeder都很好，这次分装后怎么就成这个样子了，做了个时间梯度1.5h./2h./2.5h,发现1.5h死的少些，但是好像灭活不全的样子，请教各位战友是什么原因，急求改进，不胜感激。。。。。。

jojo1988509

你会不会是分装时没有吹均匀啊，导致个别分装管浓度太大了。

stemcellmeng

有可能是这一次细胞状态的关系，有没有看一下MEF细胞的状态如何？因为其他的操作看起来没有大问题，最有可能出问题的就是细胞这里。
5 j) m# k& Y6 Z7 s- ?另外有一个建议就是溶解丝裂霉素的时候不要加20mlPBS，加1ml或者2ml就完全够了。如果使用20mlPBS溶解的话，处理MEF的时候培养液里有1/10就是PBS，对于细胞状态的维持不是很好。时间应该没有问题，一般3h是可以的。

qiushuiwuhen

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0 M# u& r$ \! _8 e4 B- o) s2 t3 P6 V$ l2 W
非常感谢你的建议，关键是我这次都已经灭活好几批细胞（细胞的状态都还行），但是灭火后状态都不好，我还将上次剩余的丝裂霉素灭活做了对比还是不行，特别着急，我的时间是一般都是2.5h,pbs清洗5-6遍，胰酶消化，培养基中和，吹打细胞后离心弃上清，技术后铺板（六孔板也是预铺明胶）。。。。。。有什么建议或者意见可以再提，谢谢！

qiushuiwuhen

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! c5 o9 _, v' W( s' J" T
" |% n9 ~5 ~3 b' V这个可能性比较小，因为过滤之后我就开始分装了，后分装时不断地摇晃管子，尽量保证浓度的均一

懵懂干细胞

MEF细胞取的几代的？养了多久后处理？

wateryong

用Mitomycin C处理之后可不可以不消化铺板。等细胞密度合适的时候直接处理，清洗两遍之后，直接用来培养ES。我们实验室就是这样做的。消化传代对细胞的影响还是挺大的。

qiushuiwuhen

回复 懵懂干细胞 的帖子3 }# N! ~, B! @" x

% l, E/ R9 b' Y; G8 \我一般都用2-3代的偶尔使用1带的细胞（已经没有组织块了），传代后养1-2天，密度有80-90%左右灭活

qiushuiwuhen

回复 wateryong 的帖子5 c* j2 O. V) W

, n* G" D/ o$ f7 u6 ^7 k嗯，谢谢，建议不错，关键是我以前都是这么处理没问题，这次我觉得是出问题在丝裂霉素及后续的分装的问题上了，但是都是我一人操作，为什么以前没有这次就不行呢，特别郁闷

dmz

也可能是丝裂霉素C批次的问题，因为不同批次的质量是有可能存在差别的，您可以尝试联系厂家。