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一、关于血清灭活" {3 T8 i! p$ F: S8 Z' j
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1、热灭活血清的原因
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加热可以灭活补体系统.激活的补体参与溶解细胞事件,刺激平滑肌收缩,细胞和血小板释放组胺,激活淋巴细胞和巨噬细胞.在免疫学研究,培养ES细胞,昆虫细胞和平滑肌细胞时,推荐使用热灭活血清.9 g. X6 {" k" Z5 D J( w- D' ?
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2、有无必要做热灭活
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+ S8 Q u' g% o! L) A9 _# o0 v 实验显示,经过正确处理的热灭活血清,对大多数的细胞而言是不需要的.经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进,或完全没有任何作用,甚至通常因为高温处理影响了血清的质量,而造成细胞生长速率的降低.而经过热处理的血清,沉淀物的形成会显著的增多,这些沉淀物在倒置显微镜下观察,像是“小黑点”,常常会让研究者误以为是血清遭受污染,而把血清放在37℃环境中,又会使此沉淀物更增多,使研究者误认为是微生物的分裂扩增.% ?% E: K( O( l3 f
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因此建议您,若非必须,您可以不需要做热处理这一步.如此一来,不但节省您宝贵的时间,更确保血清的质量!
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) s% I0 y( h/ m$ _: x1 C 3、怎样避免产生沉淀物5 Z" G; N/ J, y% b- v! N
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建议您在使用血清的时候,注意下列的操作:6 I1 Z2 W% _( @9 G6 A' ]
& |, a8 A2 Y, |: F6 C- } (1)解冻血清时,请按照所建议的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温),若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃),实验显示非常容易产生沉淀物:5 h' h: _& c2 K( C2 @7 g+ D
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(2)解冻血清时,请随时将之摇晃均匀,使温度及成分均一,减少沉淀的发生;. y/ g. X3 H W7 L6 n
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(3)请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久,血清会变得混浊,同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害,而影响血清的质量;
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(4)血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多,若非必要,可以无须做此步骤;
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(5)若必须做血清的热灭活,请遵守56℃,30分钟的原则,并且随时摇晃均匀。温度过高,时间过久或摇晃不均匀,都会造成沉淀物的增多.& ]! s+ A0 U; p; [/ f: w
8 E6 r/ q8 m' B \8 Q3 \( Q! n 二、关于血清保存冻融要点
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1、需要长期保存的血清必须储存于-20℃冰箱;
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( D# k& h( v9 {" m( C 2、4℃冰箱中保存时间切勿超过1个月;# q7 |6 p2 l3 d# [/ I: n
" W: Q, K! V) Z0 O 3、由于血清结冰时体积会增加约10%,血清在冻入低温冰箱前必须预留一定体积空间,否则易发生污染或玻璃瓶冻裂;& Q' K, ^4 Q+ D+ _- E" r9 G) p7 h- q# m
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4、血清一般为无菌,因此不用再过滤除菌;/ K. Q$ E+ n' ?: `! t# N( p
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5、如发现血清有悬浮物,可将血清加入培养液内一起过滤,不能直接过滤血清;
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! s/ `* b; {5 L6 d; \( R/ V- x 6、血清解冻时需采用逐步解冻法,从低温冰箱中的血清放入4℃冰箱中溶解1天,然后移入室温待全部溶解后再分装;) `5 H6 T# o$ f
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7、在溶解过程中需不断轻轻摇晃均匀,注意不要产生气泡,不要产生沉淀;
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8、不能直接将血清从-20℃进入37℃解冻,这样因温度改变太大容易造成蛋白质凝集而出现沉淀;8 }9 r8 G9 T$ q# x+ G
6 V3 j9 R; v+ H 9、血清灭活是指56℃加热 30分钟处理已完全解冻的血清,加热过程中应该摇晃均匀。使血清中的补体成分灭活;5 a% C9 E! `% l% |0 g/ M
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10、除非必须,商品化血清不需要灭活处理,热处理会造成血清沉淀物显著增多;$ w0 c* \% T7 c7 e/ p1 B
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11、不能将血清在37℃放置超过2天,血清会变得浑浊,同时降解血清中的有效成分;
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# F* N( N& n+ {: I7 p 12、血清中的沉淀絮状物主要是血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成,这些絮状物不会影响血清质量,3000rpm离心 5分钟即可去除;
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13、显微镜下小黑点是由于经过热处理过的血清,沉淀物的形成会显著增多,有些沉淀物在显微镜呈现为黑点,常误认为血清受污染;
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% L2 u8 T" V4 q6 Q" l) H- f R 14、通常,黑点不多时不会影响细胞生长.
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