关于脐带间充质培养的问题

大少爷

主要原因应该还是培养方法的问题，我们一般会去掉羊膜和血管，剪切成 1~4mm3的组织匀浆块，每T75瓶接种 0.5~0.6g ，9ml培养基，培养第 5~6 天进行全量换液（这期间不作处理），将培养瓶中的未贴壁的组织块和旧的培养基一起合并转移到 50ml 离心管，离心去上清，培养基再重悬，等量均分到原来的培养瓶，然后定容至 10ml/T75 培养瓶。全量换液时其实有好多组织块并未贴壁，不用担心，继续培养，正常情况在8天左右就会有细胞长出来，在11天左右进行一次半量换液（动作缓慢，吸7加10）即可，这样细胞增殖就很理想了。如果在11天左右换液时还是没有细胞，也不用担心，继续培养，15天左右再进行半量换液，继续观察和培养，期间尽量减少培养瓶的晃动。17天左右没有细胞长出来，估计就是其它问题（脐带问题的可能性很小），培养过正中尽量用新配制的培养基。- x' J6 a8 S/ ~

nkcell

即使是放在培养基里也要放大约12天才能长满平皿，正常这12期间只需要换两次液体，加的液体以刚刚覆盖组织块为好

呵呵

倒置时间有点短，我们一般倒置时间比较长。加也是梯度加，没你这么快和多。

scarletkiki

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我用的10cm的dish, 贴组织的时候不要加太多液体， 直接加2-3ml液体，只要把组织浸润就可以了， 放置24-48h 后，再加3ml液体， 直到72h后， 再加到正常液体培养，7天后开始换液，可以看细胞爬出情况做半量换液

edwardellen

还要考虑你这一次用的组织是什么情况，还有你的血清和培养基的情况，如果组织不新鲜或者保存不当，或者血清存放太久等有问题，都会影响的。+ |7 d: H' l# B) z% A1 y: R; }
另外就是和那个供体的关系也很大，我以前做过一个，那个脐带看着就不太健康，养了20多天才有细胞爬出来，出来细胞的状态也不好。
3 p) K2 M; ]/ D- s" ?; h9 r如果能做酶消化，还是做酶消化吧，好歹直接能看到细胞。
8 W9 x+ ~: o# N# ~剪组织的时候不能有液体，有液体会降低胶质的粘附能力，一般剪到足够小，均匀的铺在板底，马上就放进培养箱，不用倒置，做完最后一盘，从第一盘开始加培养基。& Z( \& U. U) P7 x
加培养基的时候要注意缓慢，不要冲击组织，一般10cm的平皿，加8-10mL培养基，放进培养箱里就不要再动了，一周以后拿出来看，基本就能看到有细胞爬出来了。' y9 @$ x- T7 p" x$ K& o, _

小跑

      我刚开始培养时也遇到和楼主类似的问题。前期买的培养基DMEM/F12加胎牛血清，买的国产某品牌胎牛血清，质量不好，怎么都培养不起来。后来换了无血清培养基套装，总算培养起来了。刚开始不能急，三天时间太短，细胞还几乎没有爬出来。组织块剪碎后不要洗，直接加液培养5天，期间不要动它，五天后再进行换液就行。看到有位前辈说换液时未贴壁的组织块及上清再次离心重悬，加入原瓶培养，我觉得是个不错的建议。酶解法确实比组织块法更快。

hwlightning

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大少，那个接种到T75培养瓶怎么做才能摆好，剪好的组织匀浆很难分成一块一块,还有不好粘液和气泡。2 a# K% k6 c- e) v
还有个问题，不是所有组织块都能爬出细胞，有的组织块爬的快，有的慢，这样就只能根据爬的快的去传代培养吧！！！

chenlin080102

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Ivan0108

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有好的方案也给我发一个，谢谢啦。  我做的不知道什么原因，方法都差不多接种90mm培养皿，第六天全量换液，到第十二天的时候才勉强看到一个皿有两个组织爬出细胞来。（脐带采集下午4点，操作是第二天上午十点）

alicia_86

一般来说第7天就有细胞爬出来，12天还没爬出来肯能你剥离血管和羊膜的时候把华通氏胶也给剥离损耗了。如果一开始做技术不好可以不剥离羊膜不影响细胞爬出来和纯度。组织块接种后放置培养箱4-5h后再加液。我们75T的培养瓶就加5ml液。第4-5天换液。第6-7天就大量细胞爬出来。