H9细胞转染后加药出现细胞成片死亡，像是没贴紧浮起来一样，请问是怎么回事啊

ailiszhang

求各位大神告知，谢谢啦

chenlin080102

浮起来的是死细胞吧

hyde

药杀阴性对照是什么样子的，如果对照死的一样多说明转染的效果不好吧

hyde

药杀浓度是否摸索过，什么药物，什么浓度，hes每个细胞系对药物敏感性还是有所差异的，要事先测试一下，浓度太高会死的比较多。

ailiszhang

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谢谢回答。
8 o" \* I; }- I$ X& M% V请问阴性对照是什么，有什么作用？药筛过程中还需要设其他对照吗？
! E) I. [0 z& s9 O: A7 Z; T7 [我做的H9细胞，puromycin筛选，药物浓度最开始加的1ug/ml，死了很多，后来降到0.5ug/ml，第二天细胞就漂了一些，第三天全死了。按照实验室师姐摸索的浓度来加，细胞基本没怎么死。

hyde

% Q! A$ ?2 f1 H# M" n" d! ]( c
+ V7 Y, z! C. T( h- V0 W- D回复 ailiszhang 的帖子
. Z: C- P$ J# y. e& @% N8 _8 @/ u" Q5 d& r' I
阴性对照就是药杀对照，瞬转质粒停留的时间比较短，不能杀太久，对照死完了就停药。我也差不多用0.5的puro，转染的质粒带gfp标记吗，或者做个阳性对照看看转染效率吧。另外，药杀前先将克隆养大一点再杀。

ailiszhang

回复 hyde 的帖子7 v' R$ X. X6 }# C* z4 c, N

- [# u. j1 q: J我用的载体中没有GFP，只有PURO抗性基因，做的电转，想得到稳转细胞系。
9 f* x6 m2 f8 T2 x. T6 A/ E我还是不太明白，阴性对照就是没有做转染的正常hES吗？还有阳性对照怎么做呀？克隆大一点具体怎么来判断呢，看直径还是细胞数目呀？你们一般转染后多久加药呢？加药后是每天全换含puro的培养基吗？什么时候停止加药呢？  
: [; e9 A1 l8 @- F; u3 F另外，如果有这方面的文献，可不可以分享一下呢？$ S( U; Y% ?4 F8 `8 B5 f
问题有点多，可能问得也比较白痴，还请不吝赐教，谢谢！

hyde

稳转？用病毒不是比较容易嘛。稳转就等克隆长大，但没有长在一起的时候，长在一起之后不容易杀，而且孔板的边缘也不容易杀，传代后再杀几次（我一般传几代接着杀杀，保证细胞系的纯度）。阴性对照最好找个带gfp，没有抗性的质粒，这样可以先看看电转的效果，这些细胞也不抗药，杀完为止。不一定每天换液，看细胞多不多，非常少的话我会隔天换的。

ailiszhang

回复 hyde 的帖子1 d5 X9 p/ J& b

4 E; Y) w( o' K& }  \  \8 f  y这两天克隆中间出现黄黄的东西，而且边缘爬出梭形样细胞，是不是分化了呀？每次加药后的第二天细胞就会死很多，之前我会停止加药几天，这次没停药，继续加了，不知道明天细胞会不会一个不剩，目前的状态看起来不乐观，好心塞。

l19rna

回复 ailiszhang 的帖子$ U# L9 C. L2 T& D. B! \8 j; f
, @: M5 n/ P% h( p& B
你得传代了，样细胞的基质不行了啊