新手求指导脂肪干细胞的原代培养

Cyclone2009

养细胞新手，今天第一次做了大鼠脂肪干细胞的原代培养，有些疑问，求专业人士指教。。
; P9 S9 e- k+ p1 @1. 我是取得SD大鼠腹股沟区的脂肪组织，大剪刀剪碎，然后眼科剪剪8分钟，看起来像浆糊样。然后用1型胶原酶，0.1%，量大约为脂肪体积的2倍，37度摇床45-60min消化。消化完成后，加入等体积培养液中和，吹打的时候发现很难吸上来，应该是内容物太粘稠了（用的一次性的塑料10mL 移液管）,是不是说明剪的不够碎，或者胶原酶加少了？另外，想请教下如何判断有没有消化好呀？7 K4 V! E" B9 W* ^$ `. g; g* P
2.中和后1000rpm 10min。发现最上层是脂肪，离心管底部有灰白色的絮状物。基本没有牢靠固定于底部的沉淀。。这是什么原因呢？还是细胞是在这些絮状物里面？8 \1 k" `1 }. ]" e7 A' }% M
3. 然后我重悬了离心管底部的这些东西，100um细胞滤网过滤，1500rpm 5min. 发现离心管底部也只有很少的沉淀，仍然看上去像絮状物。硬着头皮往下做，10ml培养液吹打，接种。。
1 F8 b, D' R- U2 P4 B% c8 K4.显微镜下看到不少 大的小的亮点，感觉像脂肪滴。。请问下是不是当天看不到细胞状的东西？那一般几天可以看到细胞贴壁呢？9 ]* U% K$ K' u, G: m
5.上述就是我的基本步骤，是不是有不对的地方呀？特别是第2和3部，希望高手能够指点。。小白感谢不尽

Cyclone2009

没有人吗?真心求指导。。

yuanyecat

1. 那个是你裂解后蛋白什么组织的加一点脂肪混到一起形成的一层，静置以后，你要去掉，还有你是不是培养液加的不够，一般是1:1，有时候也用1:2。3 t! ]& e& p! ^
2. 白色的那个是没有完全分解的组织还有一点细胞，你不用管它，用滤网之后就没有了
: s2 b: k! q1 N" @$ n. d4 r3. 用100的过滤之后，你还可以用更小一点40再过滤一次
- N1 L# o' V1 [, `" i4. 贴壁24小时以后可以看到。