原代培养脂肪来源的间充质干细胞-day3

Cyclone2009

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第一次做脂肪干的原代培养，贴了两张图（图一，二），都是提取后第三天的。大家看看像脂肪干么？当然后面我要做三向分化和流式的。9 c* W: f3 l# V! G  R# ]
首先LZ犯了一个错误，一只SD大鼠提取的脂肪组织大约3-4ml，是不是最后接种在T25的flask培养比较好？ 我没有注意到种在了T75的flask，导致密度特别稀，是不是不太好养活了呀？
$ |6 o, s  Z. W! ^$ ?, `另外想请教两个问题：
$ v1 p. z% i+ g1. 我是用0.1%I型胶原酶，量为脂肪体积的两倍，这个量合适么？嫌多么？' W8 x9 q9 t) ~& ~
2. 我是在37℃的空气摇床上摇1h消化，摇床的转速是220转/min，是不是太大了，把细胞都摇碎了？调整成100r/min不知道可不可以？
/ X- O: M; J1 Y4 F3 i图一：
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: A/ x4 D7 N' u" q7 d图二：  l5 r: S* O$ }& {" s3 U6 M
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3 l8 `6 K5 \# O! ^6 D0 K2 I图三：我在flask还看到这些个东西，感觉类似于铺路石，是晶体还是内皮细胞也贴壁了呀？% s# ^0 k5 [3 x. x: c

; y, m2 _% ?) X  p  F+ M$ ?" v' ]) v( g+ I
图四：这个是实验室一个staff做的脂肪干，现在是P3，怎么细胞形态像蜘蛛一样的多角形，梭形的很少，是细胞不好了么？请专业人士指导呀？5 e: d# |8 p) i

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谢谢！！

saier.HK

1.那个浓度的胶原酶可以；
; b% a& S3 m3 k5 L; O& b* [2.最好37℃水浴摇床，这样效果更好；+ V, A9 I# }9 ]$ F' B
3.明显细胞太稀，刚开始最好种的密度大些；
, N7 y0 S5 [2 l( `4.细胞太杂，并且细胞好像缺营养，15%FBS DMEM较好（个人经验）；& |* w3 t& v* }4 K: g* V" a( M
5.这个细胞量肯定不够你后续的实验用。祝你好运！

hefan1234

1.胶原酶浓度还可以；
" f; {+ V& ?$ E2 L9 h2.我们实验室也是37℃摇床，不过转速是150r/min，30min（主要看你的胶原酶效果好不好，效果好的话半个小时差不多了）；
# z! k6 @0 W4 H, k+ x3 g3.细胞的确中的太稀了，建议开始种T25的培养瓶；6 ]& M( y( E" i4 u
4.同楼上，也是用的含15%胎牛血清的培养基；

Cyclone2009

回复 hefan1234 的帖子/ m* r  T; r' {  _( H
3 H- ^  W( b$ D2 ?0 e$ a% Q7 f
感谢呀。。5 H1 r! I) }% i7 @1 k
想问下你们是如何判断脂肪消化的差不多了的呢？
( _8 P" |4 @# c$ w7 l2 t乳糜状？

hefan1234

回复 Cyclone2009 的帖子  ^/ ^6 E: K9 n$ O/ U9 t
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是的，差不多乳糜状，主要是脂肪小团块都被消化掉就差不多了，消化太久脂肪干细胞活性变差。我们培养的是人脂肪干细胞，脂肪块消化前经过清洗剪碎，发现消化过头的脂肪干细胞活性不好且容易提前老化。你做的小鼠脂肪干细胞，看图片主要原因应该是种的太稀了，没贴壁的细胞有但不是很多，所以不能判断是否消化时间过长或转速高导致细胞活性低。

Cyclone2009

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, T: }' l  y( a$ e/ N恩，十分感谢指点。
$ f3 ?$ N" B9 m/ ~我觉得可能是种在T75 flask的原因么。提取的脂肪就3-4mL，种那么大的flask应该会导致细胞密度太稀了吧。。
, s* n# e2 y  k; j: X下次准备用T25 flask接种。。6 ^* {2 H( {/ T9 o0 z7 s
再次感谢啦！！