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RNA-sequencing数据处理流程7 R( v) K/ Q6 g8 C8 u
9 V+ b" x. Z3 B2 |0 G r5 S
RNA-sequencing技术已经逐渐取代microarray技术，成为转录组研究中的重要的高通量技术。我以前作了若干年microarray基因表达数据分析，也就是最近才开始作RNA-sequencing数据分析，现在把我了解的RNA-sequencing数据分析的流程写下来，一方面是给我自己增加印象，而且如果有错误的话希望得到大家的指正，另一方面是希望能对也使用RNA-sequencing技术的朋友有一些启发作用。
* x6 }* y+ [( q% g: k! ] o2 ^3 p7 U6 Q2 [
因为目前RNA-sequencing处理流程的每个环节上都有不止一种方法，这里我着重叙述我使用的方法，对于其他的方法我只能提及，但无法一一详述。另一方面，我这里处理流程从原始sra文件开始，到形成表达数据计数矩阵（count matrix）为止，所以严格说，这篇应该叫RNA-sequencing数据“预”处理流程。之后的differential expression分析，聚类分析，GO term分析，binding site分析以及pathway分析，在此我也不作详述，如果有朋友感兴趣，我可以在未来一一介绍。
4 ~# J6 G! \/ ?. k; S( t8 q' a7 ~0 ] H9 l0 a$ }& {
RNA-sequencing处理流程和microarray处理流程在“预”处理阶段差异较大，而在后续的处理差异较小（仅differential expression分析有差别）。RNA-sequencing“预”处理主要分四个步骤9 V( w- _9 {. m# ~4 z9 n* a4 ~3 O
第一步：下载.sra文件。在Bioconductor的SRAdb包里有方法可以下载.sra文件。假设有SRA Accession号，具体的操作如下：
6 D. r& O6 h+ B; { library(SRAbd)# z# c6 C' }/ J6 C, f
library(DBI)5 Q. G8 [2 C0 P. i+ ~
if(!file.exists('SRAmetadb.sqlite'))
3 e' a" C' y6 a2 p0 U( W srafile <- getSRAdbFile()! i* X! C" L2 y6 [
else& V$ I, S2 L$ x
srafile <- 'SRAmetadb.sqlite'
+ l% r. A; q2 x' L! \ con = dbConnect(RSQLite::SQLite(), srafile)
( S3 r$ P7 V1 h, W+ R' r df_srr <- listSRAfile(sra_accn, con) #sra_accn为已知SRA Accession号) @! p# n+ [2 J/ g1 B
l_run <- unlist(df_srr["run"])
% a o4 j. W! l4 q1 z- c getSRAfile(l_run, con, fileType = 'sra')
( [( d5 D# y0 W. F如果不知道SRA Accession号，可以通过NCBI网站搜索。) V$ W. t/ R( i! `
第二歩：转化.sra文件为.fastq文件。我们需要下载SRA Toolkit，使用其中的fastq-dump命令来完成转换。8 t9 B$ N3 L, O* ~
第三步：对应RNA片段到参考基因组。这一步，有很多工具可以实现，比如BWA，Bowtie/Bowtie2，GSNAP，TopHat2，或是STAR。这里我介绍STAR工具。STAR工具包可以在https://github.com/alexdobin/STAR/releases下载。同时，我们还需要下载genome fasta sequence文件和annotation GTF文件来产生参考基因组。以人类homo sapiens为例，我们从ENSEMBL（ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-81/......）下载FASTA和GTF文件。使用STAR命令两次但是不同的参数来分别产生参考基因组和对应RNA片段到参考基因组。具体的操作如下（命令行）：: k" D7 {5 S2 {+ S
STAR --runThreadN 这里是个数字表示多少线程 --runMode 在产生参考基因组阶段这里必须填genomeGenerate选项 --genomeDir 这里填你希望产生的参考基因组存放的路径 --genomeFastaFiles 这里填下载的FASTA文件路径 --sjdbGTFfile 这里填下载的GTF文件路径- F6 g4 Z. d5 U! T; R) C
产生完参考基因组之后，就是对应RNA片段到参考基因组
8 D. Q! F0 v: B0 R STAR --runThreadN 这里是个数字表示多少线程 --genomeDir 这里填产生好的参考基因组存放的路径 --readFilesIn 这里填已经准备好的.fasta文件路径3 @# @: w: H$ O. \' x
这样就可以产生.sam文件，我们再需要通过samtools把.sam转化成.bam文件，操作如下 K! c% c8 N7 G0 K
samtools view -bS xxxxx.sam -o xxxx.bam( R+ k% h! L. r0 h
第四步，我们要利用产生的.bam文件获得count matrix。这也有几个工具可以实现，比如python的HTSeq包，Bioconductor的Rsubread包和GenomicAlignments包。我使用GenomicAlignments包。完成这个任务，也需要几个步骤：# E; G( y8 g1 t. [8 U; J" W3 t
1） 我们需要定义基因模型（gene models）。简单的方法是直接使用Bioconductor现有的，比如TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knowngene包；
- f e* j6 C3 n' Z 2） 产生一个GRangesList对象；- v/ h: U! M7 Q6 L/ U8 @1 n
3） 把产生的若干.bam文件放入BamFileList对象中；
% y" P" c, ]. ~9 D6 x4 y 4） 使用summarizeOverlaps方法产生count matrix。, F. b) r! m$ E' f: c
具体操作如下：0 v9 ]( k$ U3 L* B
library("TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene"). i: {4 o( i5 I; c
library("Rsamtools")
3 J# K5 P7 d0 b8 d; B" |% H library(GenomicAlignments)
( s1 J/ u9 l! U- Q- S/ O, f bamfiles <- BamFileList(filenames, yieldSize=2000000)
- b: F7 G; L1 Y9 N exByGn <- exonsBy(TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene, "gene"). o2 w" s1 b O4 T& J0 v7 y
flag <- scanBamFlag(isNotPrimaryRead=FALSE, isProperPair=TRUE): k- V% h( @) ~& s r
param <- ScanBamParam(flag=flag)0 E! w$ v/ z9 j
CntMat <- summarizeOverlaps(exByGn, bamfls, mode="Union", ignore.strand=TRUE, single.end=FALSE, param=param)
( `" i/ X! M8 Q* N9 ^' ~最终，我们就获得了CntMat，可以开始一系列后续的分析处理了。+ ?6 ?, n2 E- [2 i# I3 U
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发表于 2015-8-14 18:14
发表于 2015-8-17 23:40
