师姐真传的一些免疫组化技巧

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1、做前防护：二甲苯有毒易挥发，二甲苯可以诱导白血病。必须在通风厨中脱蜡和透明。
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: S. G# z6 E- |( V/ a& u* z2、脱蜡前将石蜡切片放入60度烘箱中烘烤2个小时，有助于脱蜡，并可以防脱片。6 \% |0 o. ?3 ~5 ]6 h
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3、提高温度有助于二甲苯脱蜡，冬天时，可将二甲苯先放入37°孵箱中保温，再进行脱蜡，提高脱蜡效果。
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4、脱蜡过程，最后一步二甲苯应尽量保持新鲜二甲苯，同时将上次的二甲苯依次往前一个二甲苯中更换，因为最前的二甲苯是石蜡残留最多，越往后的二甲苯中石蜡越少。4 x. T, O  G* M. ]
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* s$ k- ^+ S3 G) b5、水化过程，最后的一个乙醇也应该勤换，同理，最后一个乙醇中的二甲苯最少。4 L+ i& a  N# d: O$ X2 Z

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4 g9 A' r2 Y8 k" _6、消除内源性过氧化物酶建议用3% H2O2（甲醇 90ml+H2O2 10ml）（PS：H2O2原浓度是30%的，变成3%应10倍稀释）, 甲醇具有固定作用，有助于保护组织。
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3 ]! f# i2 H/ u7 P7、抗原修复，0.01M柠檬酸钠缓冲液（PH 6.0），建议使用高压锅来抗原修复，高压锅温度较为稳定，微波炉抗原修复火候控制不稳定，导致修复液经常沸腾时易引起脱片。
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4 o8 ~' ~3 e! @1 E' x+ m& l" [" i5 A8、封闭前，建议使用免疫组化笔将组织部分画圈，防止抗体流出片子。很好用的，不过500个大洋哦。9 n* T/ n! E" B. @7 F
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, E1 r# \  w! i& ]5 z9、DAB显色程度把握，在目的组织处，显现出黄色或者棕色颗粒状时，而组织边缘尚还未显色时，终止显色。简而言之，在边缘效应出现前，而目的蛋白显色出来时终止最佳。% o/ y2 b6 {1 e9 Y: y; b

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10、封片前，脱水步骤即为水化的反方向操作，注意事项同理。2 ]4 Y! O, b9 F/ z& J

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' {$ [% a' u& }1 {11、免疫组化拍照时，高倍镜下视野模糊，无论如何调节显微镜焦距都无法清晰时，考虑脱水没有脱干净及切片未二甲苯透明。( k% Z1 {) o  h( y7 \9 h: T
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12、免疫组化结果好坏判断：目的蛋白成黄色棕色细沙或细颗粒状，蛋白显色定位正确，核还是浆。背景无色，细胞核蓝色。
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图挂了？5 ]1 S4 O% n3 O7 U3 v* I
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不过免疫组化觉得抗体最重要了，米有钱换好抗体，做到死都做不出来好结果。

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免疫组化其实最应该讲的经验是：如何选择好的抗体？我们用过好些抗体，结果发现很多文献报道的抗体都不行，有的甚至发了CNS paper的，一个可能原因是抗体批次不一样，另外可能的原因是抗体本身的可用性没有经过严格论证检测！所以不要轻易相信商业化公司的抗体说明书。推荐抗体使用指南这本书，有中文电子版的

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免疫组化，一抗和二抗都很重要，要产生漂亮的图，取决于抗体的质量，有时候能用于免疫组化的抗体，不一定能用于western blot。以前使用GFP的抗体，能染出好的图片，但western blot中就有很多杂带。
. O' Z; ^% G- W' ?& V你们有类似的经历吗？